ADSC—bFGF对大鼠背部带蒂皮瓣存活率的实验研究

刘丹等

[摘要]目的：脂肪來源间充质干细胞复合碱性成纤维细胞生长因子（ADSC-bFGF）对大鼠背部带蒂皮瓣模型存活率的影响。方法：获得SD大鼠腹股沟脂肪，经体外分离、培养并进行多功能分化潜能的鉴定。MTT法检测bFGF培养液对ADSC的影响。建立大鼠背部自身对照带蒂皮瓣模型。应用CM-DiI荧光染料标记ADSC。在皮瓣可预测坏死区域分别给予A1组bFGF、A2组ADSC、A3组bFGF-ADSC、B组生理盐水。全部动物于术后7天测量皮瓣成活面积、HE染色、冰冻切片的CD31荧光显影，统计学分析ADSC-bFGF促进皮瓣成活的作用。结果：bFGF有明显促ADSC增殖作用，增值最快的最低浓度为5μg/L。A3组皮瓣成活率、毛细血管增生均显著高于其它组。结论：bFGF可促ADSC增值，具有协同作用。ADSC-bFGF可高效的刺激大鼠背部自身对照带蒂皮瓣的血管新生，显著的提高皮瓣的成活率。

[关键词]脂肪来源间充质干细胞；碱性成纤维细胞生长因子；大鼠背部带蒂皮瓣

[中图分类号]R622 R332 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2013）08-0829-04

提高皮瓣的成活率，促进皮肤创伤修复是目前临床工作需要解决的关键问题，因此研究寻求有效的方法预防术后皮瓣的缺血坏死具有重要的理论和临床实际意义。使用各种不同的动物皮瓣模型往往会导致难以解释的实验结果。本研究采用可预测皮瓣坏死面积的带蒂皮瓣模型，并改进形成自身对照皮瓣。目的是通过使用ADSC-bFGF局部注射，刺激大鼠实验组皮瓣模型的血管新生，从而增加皮瓣的成活率。

1 材料

1.1 设计：采取随机，对照，动物实验。

1.2 实验材料：健康纯种雄性SD大鼠，质量为400～500g，21只，250～280g，10只。（哈尔滨医科大学动物实验中心提供）。DMEM-F12培养基、胎牛血清（美国Sigma公司），油红O（美国Sigma公司）；2%茜红素染液（美国Sigma公司），噻唑蓝（MTT）检测试剂盒（ 武汉博士德） ，二甲基亚砜（美国Sigma公司），CM-DiI（美国Molecular Probe公司），小鼠抗大鼠CD31抗体美国Abcam公司）；贝复济（珠海亿胜生物制药有限公司）山羊抗小鼠IgG-FITC（中杉金桥）；酶标仪（日本Reader仪器公司）

2 方法

2.1 脂肪来源间充质干细胞 （Adipose derived stromal cell，ADSC）的体外分离、纯化、扩增培养：取250～280g雄性SD大鼠，无菌条件下采集双侧腹股沟脂肪，0.1%Ⅰ型胶原酶消化，用含10%胎牛血清的DMEM-F12终止，离心重悬，以3×104个/cm2接种于25cm2塑料培养瓶，置于 37℃，5% C02的孵箱内培养，72h换液，弃掉未贴壁细胞，每3天换液1次。通过多次传代获取纯化的ADSC。

2.2 ADSC分化能力的鉴定：向培养ADSC的6孔板加入成骨、成脂诱导液，4周后进行茜素红染色、油红O染色检测。

2.3 bFGF对ADSC增值影响：取第5代ADSC接种于96孔板，细胞贴壁后每孔按0、2.5、5、10、50、100μg/L浓度加入bFGF培养液200μl，每个浓度3孔；48h后检测，加5 g/L的MTT 溶液20μl，37℃孵育4 h，弃孔内液体，再加二甲基亚砜150μl低速震荡10min，用酶联免疫检测仪测A490值，并记录结果。重复3次实验。

2.4 DiI荧光标记ADSC：注射细胞之前，取第5代细胞用无血清培养液制成2×106/ml的细胞悬液1ml，加2μg/ml DiI染液，37℃孵育30min，离心重悬后，倾去染液，加PBS溶液制成1ml细胞悬液，孵箱孵育5min后移入4℃冰箱备用。

2.5 实验分组及治疗：实验动物21只，每只分为左侧实验组A组（随机分成A1、2A、A3）、右侧对照组B组。A 1组：注射bFGF；A2组：注射ADSC；A3组：注射ADSC+ bFGF；B组：注射生理盐水。

2.6 大鼠背部自身对照带蒂皮瓣模型的建立：健康纯种雄性SD大鼠，400～500g，水合氯醛（10%）腹腔注射麻醉（3ml/kg），自身对照皮瓣模型设计成两个等大矩形，大小3cm×8cm。消毒铺巾，沿设计切口线切开皮肤至深筋膜层，沿头尾方向掀起皮瓣，离断全部穿支血管，仅保留两侧旋髂深动脉为蒂，彻底止血。取经标记的ADSC，对A1、A2、A3、B组分别注射bFGF、ADSC、ADSC-bFGF悬液、生理盐水，注射范围是皮瓣头侧上1/3，每点均为0.1ml，总量为1ml/只，原位缝合切口。术后7天观察皮瓣 （图1）。

2.7 皮瓣坏死的鉴定：术后7天，处死动物，数码相机进行拍照，使用Image pro-Plus6.0软件评估皮瓣成活与坏死面积。通过公式R=皮瓣存活面积/皮瓣总面积×100%计算皮瓣成活率。

2.9 组织学观察：切取各组成活皮瓣远端，制成石蜡病理切片HE染色，镜下观察血管增生情况。

2.10 ADSC及CD31在皮瓣中的检测：切取A组注射细胞区域的皮瓣组织，快速制成冰冻切片，用免疫荧光染色法对血管内皮细胞特异性标志物CD31进行检测，判定微血管密度和皮瓣中细胞情况。

2.11应用SPSS 17.0 软件进行统计学分析，各组数据用x±s表示，组间比较用t检验，P<0.05，有统计学意义。

3 结果

3.1体外ADSC的培养与鉴定：ADSC原代培养2周，可达90%融合，平行排列呈漩涡状，形态以长梭形为主，可进行传代。取第3代细胞，经成骨诱导4周可见茜素红染色致密、不透光的钙化结节，呈淡红色；经成脂诱导油红O染色可见大小不等成圆性橙红色的脂肪滴；证明诱导成功。

3.2 MTT檢测bFGF对ADSC增值作用：在本研究的剂量范围内，不同浓度bFGF对ADSC的增值均有促进作用（P<0.05）。5ng/ml组与2.5mg/ml组组相比，差异有明显统计学意义（P<0.01）；5ng/ml组与10ng/ml组、50ng/ml组、100ng/ml组组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。因此， 促进ADSC增殖最快的最低浓度是5ng/ml（表1）。

3.4皮瓣大体观察及成活情况：术后1周，观察大鼠背部皮瓣，其成活区和坏死区分界明显，易辨别。图片经图像分析系统计算出 A1、A2、A3、B组皮瓣成活率分别是（86.01±1.71）%、（91.73±2.23）%、（95.12±2.01）%、（70.68±1.82）%。统计学各组分析比较，A3组皮瓣存活率明显高于A1、A2、B组（P<0.01），A1组成活率高于A2组（P<0.01）（表2，图2）。

3.5 HE 染色分析：HE染色可见，A3比A1、A2组皮瓣的新生毛细血管分布明显增多，纤维组织细胞增生明显，B组新生血管较少。

3.6 ADSC在皮瓣内的分布与检测：荧光显微镜下观察可见，经CM-DiI染色呈阳性的ADSC为红色荧光、CD31呈阳性为绿色荧光，且红色荧光的ADSC在绿色荧光的内皮细胞之间，参与构成了毛细血管的管腔结构。（图3）

4 讨论

可预测皮瓣坏死面积的轴型皮瓣模型[1]，平均成活比例为（70.5±4.8）%，这种可预测性对研究皮瓣的病理生理学有重要意义，本实验在此基础上建立自身对照的带蒂皮瓣，使个体差异性减小且对比性更强。提高皮瓣的成活率，增加血液循环及血管再生是关键。

bFGF是一种多功能细胞生长因子，是血管内皮细胞、血管平滑肌细胞与成纤维细胞的高效促生长剂，能够有效的促进新生毛细血管的形成[2-3]，从而促进皮瓣成活。刘斌[4]等证实应用bFGF可促进新生微血管的数量增加，从而增加大鼠背部随意皮瓣成活面积。本实验也显示A1组明显高于B组的皮瓣成活面积。

2001年，Zuk等[5]成功从脂肪组织中分离培养出ADSC，因其具有与骨髓干细胞、胚胎干细胞一样的多项分化潜能，取材方便，损伤小，且来源丰富，又不受伦理学约束，被认为可能会成为组织工程的理想种子细胞。由于ADSC在体外容易扩增，长期表达稳定，并且ADSC移植体内在自身存活基础上，还可很大程度改善机体功能[6]。因此，在修复缺血皮瓣和组织工程方面起了重要作用。文献报道ADSC能生成血管结构和抗凋亡因子，有影响血管再形成的潜力，也可分化成有功能的内皮细胞[7-9]。本研究结果显示：成红色荧光的ADSC分布在成绿色荧光的血管内皮细胞周围，说明ADSC参与并促进了毛细血管管腔的构成。ADSC可以预防新生小鼠的缺血缺氧性脑病的发生，可增加兔任意型皮瓣的成活面积[10-11]，其主要原因可能与其具有分化生成内皮细胞，促进新生血管内皮细胞生长，增升血管密度，从而增加组织成活的作用有关。本研究中A2组皮瓣成活率明显高于B组与A1，也证明了上述观点，并且分别单独使用ADSC比bfGF促皮瓣成活率效果好。

bFGF属于多肽类细胞生长因子，对中胚层来源的细胞具有明显的促增殖作用[12]。有研究表明，bFGF可以促进猴骨髓间充质干细胞和人羊膜间充质干细胞的增殖[13-14]。本文使用含不同浓度的bFGF培养液培养ADSC，经MTT检测表明，bFGF促ADSC增值作用显著，且5ng/ml是作用最快的最低浓度；同时，ADSC移植能促进脑缺血大鼠缺血区微血管的生成，ADSC-bFGF 能刺激大鼠腹部横行腹直肌肌皮瓣的血管新生，增加皮瓣的存活率[15-16]。其机制可能是ADSC可促进bFGF的表达，bFGF又可促ADSC生长，二者相互协同，从而可显著的促进皮瓣成活面积。

综上所述，单一因素的bFGF、ADSC都能促进皮瓣成活，而且二者之间具有协同作用。本实验使用ADSC-bFGF进行皮瓣局部注射，皮瓣成活率显著高于单一使用bFGF和ADSC悬液组。说明bFGF可提高ADSC增值和皮瓣成活率的同时，后者也可促进前者的生成以及皮瓣成活。因此，多因素之间互相促进、生长，把ADSC和bFGF的优势有机结合，能更强的促进缺血组织的血管新生，增加背部自身对照带蒂皮瓣的成活面积。为ADSC-bFGF的临床应用研究提供理论与实践依据；特别是对整形外科中的皮肤组织修复具有重要意义。

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[收稿日期]2013-03-15 [修回日期]2013-04-16

编辑/张惠娟