固相萃取—高效液相色谱法测定肉制品中玫瑰桃红R

钱凯，车文军，卢剑，武中平，王燕芹

摘 要：建立固相萃取-高效液相色谱（SPE-HPLC）测定肉制品中玫瑰桃红R含量的分析方法。试样经乙腈水溶液超声提取，Oasis WAX柱净化后，以乙腈-乙酸铵缓冲溶液为流动相，经C18柱分离后进行HPLC检测。玫瑰桃红R在0.5～10.0mg/L范围内呈良好的线性关系，线性相关系数大于0.999。1.0、2.0、10.0mg/kg 3个加标水平的平均回收率为90.6%～105.2%，相对标准偏差（RSD，n=6）为1.79%～4.25%，检出限为0.26mg/kg。该方法灵敏度高、重现性好、定量准确。

关键词：高效液相色谱；固相萃取；肉制品；玫瑰桃红R；测定

Determination of Bordeaux R in Meat Products by SPE-HPLC

QIAN Kai1，CHE Wen-jun1，*，LU Jian1，WU Zhong-ping1，WANG Yan-qin2

（1. Jiangsu Product Quality Testing and Inspection Institute， Nanjing 210007， China；

2. College of Science， Nanjing Forestry University， Nanjing 210037， China）

Abstract：A solid phase extraction coupled with high performance liquid chromatography （SPE-HPLC） method was developed for the determination of bordeaux R in meat products. Samples were extracted with aqueous acetonitrile solution under ultrasonication， and cleaned up by Oasis WAX solid phase extraction. The separation of bordeaux R was carried out on a C18 column using acetonitrile-ammonium acetate buffer as mobile phase. The prepared calibration curve was linear between 0.5 and 10.0 mg/L with correlation coefficient more than 0.999. The mean recoveries at spiked levels of 1.0， 2.0 and 10.0 mg/kg were in the range of 90.6% to 105.2% with RSDsof 1.79% to 4.25% （n = 6）. The limit of detection was 0.26 mg/kg. The SPE-HPLC method was sensitive， reproducible and accurate.

Key words：high performance liquid chromatography （HPLC）；solid phase extraction （SPE）；meat products；bordeaux R；determination

中图分类号：O657.7 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）01-0035-03

近年来，在肉制品中违法添加工业合成染料的事件频繁发生。如在卤制鸡腿、鸡翅的生产过程中添加酸性橙；在腊肠的制作中加入罗丹明B；在冷冻虾仁中检出酸性红等。这些工业染料可诱发人体癌变或引起人体皮肤、黏膜或呼吸道过敏，对人体健康危害极大。

鉴于工业染料对人体健康的危害性，目前食品中工业染料的检测技术研究较受关注。国内外均有文献报道采用液相色谱[1-6]、液相色谱-串联质谱[7-16]等方法对食品中多种工业染料进行分析，但对于食品包括肉制品中玫瑰桃红R的测定还未见报道。本研究采用固相萃取净化技术，建立高效液相色谱法二极管阵列检测器测定肉制品中玫瑰桃红R含量的方法，该方法高效、灵敏、快捷，能够满足我国肉制品的市场监督与企业生产质量控制的要求。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

王中王火腿肠 河南双汇集团；精制猪肉脯 靖江双鱼食品有限公司。

甲醇、乙腈、乙酸铵（均为色谱纯） 美国Fisher公司；氨水、甲酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；Oasis WAX SPE柱（60mg/3mL）和Oasis HLB SPE柱（60mg/3mL） 美国Waters公司；玫瑰桃红R 德国Dr. Ehrenstofer GmbH公司；玫瑰桃红R用75%乙腈水溶液配制成质量浓度为100μg/mL的标准储备液；提取液为75%乙腈水溶液，淋洗液为2%氨水溶液，洗脱液为1%盐酸-甲醇溶液。

1200高效液相色谱仪 美国Agilent公司；固相萃取装置 美国Varian公司；超纯水系统 美国Millipore公司；氮吹仪 美国Organomation Associates公司；超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；涡旋振荡仪 德国Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

称取试样1.0g（准确至0.1mg）于50mL离心管中，加入5mL提取液，涡旋混合1min后，超声提取20min，以8000r/min冷冻离心5min，收集上清液于试管中。残渣再用5mL提取液重复提取一次，合并两次上清液；将上清液过Oasis WAX固相萃取柱（先依次用3mL甲醇、3mL水活化）后，用5mL淋洗液淋洗小柱，减压抽干，用5mL洗脱液洗脱，整个萃取过程控制流速约为1mL/min；收集洗脱液，氮气吹至近干，用流动相溶解并定容至2.0mL，经0.45μm微孔滤膜过滤后供HPLC分析。

1.2.2 色谱条件

色谱柱：Hypersil GOLD C18（250mm×4.6mm，5μm）；流动相：A为水（含10mmol/L乙酸铵，pH3.0），B为乙腈，梯度洗脱程序见表1；检测波长：520nm；流速：1.0mL/min；进样量：10μL；柱温：30℃。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

提取溶剂选择的合适与否会直接影响方法的回收率。玫瑰桃红R在水中有较好的溶解性，在甲醇、乙腈等极性溶剂中也有一定的溶解性。根据肉制品的基质特点，本实验分别选用甲醇、乙腈、乙腈-水溶液作为提取溶剂进行比较，实验结果表明，甲醇和乙腈的提取效率没有明显差别；而考察不同比例的乙腈水溶液的提取效率时发现，乙腈体积分数在75%时提取效率最高，因此，最终选用75%乙腈水溶液作为提取溶剂。

2.2 SPE净化过程的优化

考虑到用75%乙腈水溶液对样品进行提取时，会将一些干扰物质提取出来，如油脂、食品添加剂等。如果对提取液过滤后直接进样，一方面，在分析过程中会存在较大的干扰；另外，方法检出限也达不到分析要求。而玫瑰桃红R的分子结构中含有多个苯环，可以使用反相机理的固相萃取柱进行净化；同时，玫瑰桃红R属于酸性染料，分子结构中带有磺酸基团，因此在酸性条件下可以使用阴离子交换萃取柱进行净化。本实验比较了Oasis HLB和Oasis WAX两种固相萃取柱的净化效果。结果显示，采用HLB固相萃取柱时，在萃取过程中容易出现堵塞现象，导致回收率较低，仅为15.2%～27.3%；采用WAX固相萃取柱时，发现萃取过程相对容易，净化、富集效果理想，平均回收率为90.6%～105.2%，符合分析要求。

2.3 HPLC条件的优化

2.3.1 检测波长的选择

将玫瑰桃红R的标准溶液在波长200～700nm的范围内进行紫外-可见光谱扫描，得到其吸收光谱图。实验结果显示，玫瑰桃红R在波长520nm处有较大吸收。综合考虑组分的响应值及干扰情况，最终确定定量检测波长为520nm。

2.3.2 流动相的选择

玫瑰桃红R属于较强极性离子化合物，在反相色谱中，流动相的pH值对其保留时间、峰形有影响。根据相关文献[2-6]报道，选择了乙腈-乙酸铵水溶液、乙腈-水（0.1%～0.5%甲酸）体系为流动相进行实验，比较了不同体积比、不同乙酸铵浓度、不同pH值条件下对玫瑰桃红R的保留时间、响应值和峰形的影响。实验结果表明，在乙腈-10mmol/L乙酸铵水溶液（用乙酸调pH值为3.0）的流动相体系中，采用梯度洗脱能在较短时间实现目标物的有效分离，峰形对称，灵敏度高，结果见图1。

图 1 1.0mg/L玫瑰桃红R标准溶液的色谱图

Fig.1 Chromatogram of 1.0 mg/L bordeaux R standard solution

2.4 标准曲线与方法检出限

准确移取0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00mL上述100mg/L储备溶液分别置于100mL容量瓶中，用50%甲醇水溶液定容至刻度，配成质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0mg/L的标准系列工作溶液，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积对质量浓度作线性回归方程，以3倍信噪比计算检出限。结果表明，玫瑰桃红R在0.5～10.0mg/L质量浓度范围内呈良好的线性关系，方法检出限为0.26mg/kg，具有较高的灵敏度。组分的线性范围、回归方程、相关系数以及检出限见表2。

注：Y.峰面积；X.标准溶液质量浓度/（mg/L）。

2.5 方法的回收率与精密度

在空白样品中添加1.0、2.0、10.0mg/kg 3个水平的标准品进行回收实验，按上述色谱条件和前处理方法进行测定，每个样品重复处理6次，平均回收率及RSD见表2。结果显示，3个加标水平的平均回收率为90.6%～105.2%，RSD为1.79%～4.25%，方法具有较好的回收率与精密度，满足肉制品中玫瑰桃红R含量检测的要求。图2为空白样品及加标的色谱图。

图 2 空白样品（A）与空白样品加标（B）的色谱图

Fig.2 Chromatograms of blank sample（A） and blank sample spiked with bordeaux R（B）

2.6 方法的实际应用

应用所建立的检测方法，对肉脯、香肠等20多个肉制品样品进行测定，以保留时间和紫外-可见吸收光谱进行定性，均未检出含有玫瑰桃红R残留。

3 结 论

本研究建立了测定肉制品中玫瑰桃红R含量的SPE-HPLC分析方法，通过对提取溶剂、净化方式、检测波长和流动相等参数的研究，确定了最佳实验条件。结果表明，采用SPE方式净化试样，可有效地减少基质的干扰、提高方法的灵敏度；同时考察了方法的回收率、精密度和检出限，各项技术指标均符合分析要求，可为管理部门加强肉制品监管提供技术支持。

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