DNA条形码技术在肉品防欺诈鉴别中的应用

邱德义 胡佳等

摘 要：以DNA条形码技术鉴别进出口监督抽检的鱼肉等水产制品的种类来源，用以判别其与申报或产品标签是否相符。分别提取鱼肉等样品的基因组DNA，以目前国际上比较公认的动物线粒体细胞色素氧化酶CO Ⅰ基因通用引物进行PCR扩增。PCR产物经测序分析后，将得到的扩增片段序列与Genbank数据库进行序列比对，同时提交Barcoding Life DNA条形码数据库（BOLD）进行鉴定分析。本批次监督抽检的16份鱼肉、鱼丸等水产制品中除1份样品未能成功获得鱼肉CO Ⅰ PCR扩增外，其余15份样品均顺利得到种类来源鉴定，鉴定结果约有31.25%的样品与产品标签标示不符。作为一种简单、快速、有效的分子鉴定技术，DNA条形码可以直接应用于鱼肉等动物源性食品的种类鉴定。

关键词：DNA条形码；冷冻鱼肉；动物源性食品；种类鉴定

中图分类号：Q95 文献标志码：B 文章编号：1001-8123（2013）04-0040-04

《晏子春秋：内篇杂下第一》中就有“悬牛首卖马肉”之说，民间也有“挂羊头卖狗肉”的演绎，其根本内涵就是：表里不一、狡诈欺骗。在商贸领域表现为以次充好，甚至假冒、仿造贵重物品，欺骗消费者从而达到获取更高非法利益的真实目的。进入2013年，在有着最严格食品安全监管制度的欧盟，真实演绎了席卷欧洲列国的牛肉标识欺诈事件。不仅涉及到食品掺假欺诈的商业行为而且涉及到民族和宗教信仰的问题，引起不食用马肉和猪肉的穆斯林和犹太人的强烈不满。马肉也引发食品安全的担忧，部分马肉中已检测出苯基丁氮酮药物残留，此药物经常用于马类，有助于止痛和退热，但对人类有害。受“马肉风波”事件影响，被忽视多年的海鲜产品以次充好现象也再度浮出水面。

掺假造假的判定和标签制度的有效实施，必须建立在快速、准确的食品物种鉴定的基础上。对加工食品而言，物种的原始可识别形态特征消失，这使得物种的鉴别变得相对困难。因此，迫切需要一些灵敏、可靠的检测方法来鉴定动物食品或动物源性加工食品的物种来源。

DNA条形码技术（Barcoding）是近几年兴起的一种分子生物学新技术，原理是利用基因组DNA中一段标准的或者被公认的基因片段，作为分子靶标来进行种级水平的种类鉴定。DNA条形码技术对鉴定者的经验和专业知识背景要求较低，为物种的鉴定提供了新的手段，弥补了传统分类的诸多不足。但条形码鉴别技术需要有专门的数据库作为支撑，含有较全面的生物学信息[1-2]。

利用分子标记进行物种种类鉴定国际上已有不少的尝试，Hebert等[3-4]于2003年发表了国际上第一篇利用DNA 条形码进行物种鉴定的论文，随后Ball等[5]尝试用分子条形码鉴别了70多种水生蜉蝣，游中华等[6]用线粒体CO I鉴别了入侵害虫西花蓟马及其他8种常见蓟马；岳巧云等[7-8]将DNA条形码技术应用于出入境检验检疫把关，成功对医学媒介生物进行种类鉴定并建立数据库。Wong等[9]利用DNA 条形码技术对市场上的91个海产品样品进行分析，推断出可能有25%海产品的标签与实物不符，认为DNA 条形码技术是一种经济的、有效的、可将海产品鉴定到种的分子鉴别技术。在我国，DNA条形码技术用于食品鉴别的文献报道较少，常见的动物源成分鉴定技术应用的是特异PCR、荧光PCR等技术，也颁布了一部分行业检测标准，但其局限性显而易见。柳淑芳等[10]报道了DNA条形码技术在鱼类系统分类中的应用，为该项技术在鱼种类鉴别中的应用前景提供了有力支持。

本实验室应用线粒体CO Ⅰ片段为靶标，CO Ⅱ、CO III以及ITS等作为备用标靶和确证基因，对进出口监督抽检及口岸截获的多批次包括鱼肉、鱼片、虾饺、鱼丸等水产和水产制品进行检测鉴定，并通过分析比对进行了确认。龙利鱼（Cynoglossus macrolepidotus） 自然资源量少，味道鲜美，为一种高档海鲜。本实验将以其中一份申报为龙利鱼柳冻鱼肉的检测鉴定作为典型范例，对DNA条形码技术在进出口检验监管方面的应用做一分析和介绍。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

研究样本为从各进出口食品企业监督抽检的多批次包括鱼肉、鱼片、虾饺、鱼丸、虾酱等水产和水产制品以及口岸截获的冷冻鱼肉。

动物组织基因组DNA 提取试剂盒、PCR产物及DNA片段回收试剂盒、T4连接试剂盒、DH5α感受态细胞 天根生化科技北京有限公司；EX-Taq DNA聚合酶、dNTP等PCR试剂 宝生物工程（大连）有限公司。

1.2 仪器与设备

Sigma 1-15pk冷冻离心机 德国Sigma公司；S1000梯度PCR仪、Gel DocTM XR+凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司；DYCP-31E电泳仪 北京六一仪器厂； NanoDrop 1000微量核酸蛋白测定仪 美国Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取

鱼肉基因组DNA提取均采用动物组织基因组DNA 提取试剂盒，按照试剂盒使用手册进行基因组DNA提取，对个别鱼肉样品适当延长蛋白酶消解时间。

1.3.2 PCR扩增

PCR扩增所用引物为：LCO1490 5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3，HCO2198 5-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3[10-11]，由宝生物工程（大连）有限公司合成。

PCR反应体系（50?L）：10倍PCR缓冲液5?L；正向引物（20?mol/L）2.5?L；反向引物（20?mol/L）2.5?L；dNTP（10mmol/L）1.5?L；Ex-Taq 1?L；模板DNA 2?L；无菌水定容到50?L。

EX-Taq DNA聚合酶扩增条件：94℃变性5min；94℃、40s，54℃、40s，72℃、1min，反应40个循环；72℃延伸10min。

PCR 扩增完成后，经1%琼脂糖凝胶进行电泳分离后，使用数码凝胶成像系统分析扩增产物。

1.3.3 PCR产物测序

PCR产物直接测序时，将获得的PCR产物按照琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒说明书的操作步骤割胶纯化，送深圳华大基因有限公司进行双向测序，测序引物同于扩增引物。所得的测序结果经拼接并删除两端引物序列，获得最终的扩增序列。

1.3.4 PCR产物克隆测序

克隆测序用于验证PCR产物测序结果的准确性，尤其针对多成分肉制品的PCR产物采用挑选不同阳性克隆进行测序分析。对PCR产物进行纯化，随后按T-vector试剂盒推荐反应体系与pGEM-T载体连接，导入DH5α感受态细胞中，36℃培养过夜，经过蓝-白斑筛选后，挑取3～10个不同的白色单菌落进行菌落PCR验证。阳性克隆菌落接种到LB液体培养基（含有100μg/mL氨苄青霉素）中，在36℃、180r/min摇床上培养过夜，吸取菌液1mL抽提质粒DNA，并送深圳华大基因进行测序。测序引物采用T7通用测序引物。

1.3.5 扩增序列分析比对

PCR产物直接测序或克隆测序后，去除扩增引物序列，提交GenBank进行BLAST比对[12]，并使用BOLD网站[13]的数据库对样品的CO I序列进行鉴定以及相似度分析。

2 结果与分析

2.1 线粒体CO Ⅰ基因片段的扩增

以动物基因组DNA提取试剂盒提取样品基因组DNA后，应用CO Ⅰ通用引物进行PCR扩增，扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测。结果表明，冷冻鱼、鱼丸、虾饺、虾酱等水产品的CO Ⅰ序列可以用通用引物扩增出来，说明通用引物的通用性高，可用于鱼肉中CO Ⅰ基因的扩增。图1显示的是申报为龙利鱼柳冷冻鱼肉的CO Ⅰ、CO Ⅱ、ITS扩增及一份鱼丸样品的CO I序列扩增。

2.2 冷冻鱼柳CO Ⅰ测序结果分析

对龙利鱼柳冷冻鱼肉样品的PCR产物直接测序和克隆测序结果经Chromas软件验证，图谱一致，且为有效序列。经比对分析，从PCR全长序列中去除两端引物的碱基，所得有效序列为658bp。

2.3 与GenBank中的序列比对

冷冻龙利鱼柳的PCR产物所测定序列与GenBank中核酸序列进行BLAST比对，结果与编号gb|JN021313.1公布的654bp的Pangasianodon hypophthalmus线粒体CO I序列相似性为99.8%，其中仅有1个碱基差异。详细信息如图2所示。

2.4 与BOLD数据库中的序列比对分析

将PCR扩增并测序得到的CO Ⅰ有效序列提交BOLD （Barcoding life）DNA条形码数据库分析，鉴定结果取相似度最高的前8位，见表1。

该冷冻鱼肉样品为口岸截获，进口商在入境申报时申报该冷冻鱼肉样品为龙利鱼柳，被截获后改称巴沙鱼。本实验室取样进行CO Ⅰ PCR扩增，测序结果分别经GenBank Blast比对及BOLD DNA条形码数据库分析，鉴定名称为Pangasianodon hypophthalmus，学名苏氏圆腹鱼芒，属鱼芒鲶科（Pangasiidae），分类学上在属一级小有争议，中文名多称为巴丁鱼。目前国内水产品市场多存在混淆名称的“潜规则”现象。以本批次样品为例，国内卖家近年来通称越南巴沙鱼为龙利鱼，而包括多家水产门户网站也都将巴丁鱼归为巴沙鱼家族的一员。其实3者是不同的鱼种，巴丁鱼和巴沙鱼的区别非常小，主要是鱼的口舌位、鱼胸鳍条目数等略有差别，而龙利鱼则亲缘关系较远，更为稀有和昂贵。

2.5 水产品检测结果汇总及分析

本批次监督抽检共分析了16份进出口企业抽检及口岸截获鱼肉、鱼丸、虾饺等水产制品，经DNA条形码技术分析鉴定，除一份鱼丸样品未能鉴定出水产种类之外，其余15份样品均成功扩增CO Ⅰ基因片段，并通过GenBank和BOLD 数据库比对分析鉴定出了水产种类，鉴定结果汇总见表2。

其中，未能成功PCR扩增的8号白鱼丸样品经尝试CO Ⅱ、CO Ⅲ及ITS等多个候选标靶基因均未能检测到鱼肉成分，ITS扩增鉴定存在大豆基因成分，除证实该样品基因组DNA提取成功外，也暗示了其本身存在不含鱼肉成分的可能。从严格意义上讲，16份样品中仅有2份的鉴定结果与标签完全符合，占25.5%；约有31.25%的样品鉴定结果与标签标示不符。另有56.25%的样品由于其标签本身未能标示所含水产种类，而仅以鱼或虾的大类表示，根据检测结果尽管不能判定其不合格，但也提示了产品标签制度有需要进一步完善的地方。

需要说明的是，国际统一的生物物种命名应用的是拉丁文名称，DNA条形码的鉴定结果给出的以拉丁文名为准。而国内常用的学名及俗名则常常是五花八门，这也在客观上为一些不法商家掺假、造假提供了可乘之机。

3 讨 论

动物性食源物种种类繁多，非专业人士很难鉴别，且消费者在购买新鲜肉类、鲜活或冷冻水产品时，多是通过形态特征来判断肉或鱼的种类，但对于一些肉或鱼肉制品（如肉饼、肉丸、鱼片、鱼丸等），则很难通过形态特征来判断其原料的来源。食品行业一些不法商家正是利用此漏洞，为了追求最高商业利润，便在加工食品中掺假造假，以低价食源冒充高价食品出售，一方面大大损害了消费者的利益和健康，另一方面也造成了不正当的商业竞争。其实，在此次“马肉风波”事件之前，国内已经爆出了应用化学药物处理的“假鱼翅”、以牛肉膏处理的猪肉或鸭肉冒充牛肉等事件，但当时舆论更多地导向了食品安全领域而非商业欺诈的造假本身。

DNA条形码技术目前国际上比较公认的是以细胞色素C氧化亚基Ⅰ（CO Ⅰ）的基因作为鉴定物种的靶基因，现有的研究数据表明绝大多数物种的CO Ⅰ序列表现出低的种内遗传差异及相对较高的种间差异[14-15]。该项技术能避免形态学分类的缺陷，对鉴定者的经验和专业知识背景要求较低。相比较于特异PCR、荧光PCR等技术，DNA条形码技术有着无可比拟的优势，但是DNA条形码鉴别技术需要有专门的数据库作为支撑。由于动物性食源种类繁多，目前的DNA条形码数据库还远远不够完善，应用国际共享的DNA条形码数据库进行序列分析比对仍存在一定的不确定因素。同时，对于部分种类尤其是多成分加工食品的鉴别还需要在辅助靶基因[16]的筛选，与特异PCR、荧光PCR、AFLP及芯片技术相结合等方面进一步探索。

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