甘露糖结合凝集素与肾脏疾病

作为人体的第一道防线先天性免疫系统不断被激活，以抵御外来病原体侵害，维持机体功能稳定。吞噬细胞、自然杀伤细胞、抗体、补体系统及细胞因子等都是免疫系统主要组成分子，其中补体通过经典、旁路和甘露糖结合凝集素(MBL)三条途径激活，形成膜攻击复合物直接溶解病原体。

甘露糖结合凝集素(MBL)

MBL对于补体凝集素活化通路至关重要，血清中MBL结构、浓度和基因多态性与疾病的易感性相关。

MBL基因人类只有一个 MBL编码基因，编码MBL-2蛋白；噬齿类有2个MBL编码基因，编码MBL-1和MBL-2蛋白。人MBL-2基因来源于基因复制，位于10号染色体q11.2～q21，包含4个外显子和3个内含子。

外显子1编码富含半胱氨酸的N-末端区域和富含甘氨酸模体的7次重复序列。N-末端区域决定各亚基之间二硫键的连接，与蛋白稳定性有关。2个甘氨酸和任意氨基酸的重复组成了甘氨酸富含模体，这一区域在胶原三螺旋结构的形成过程中发挥重要作用。胶原结构域是由外显子1和外显子2共同编码，包含12次富含甘氨酸的重复序列和MBL相关丝氨酸蛋白酶(MASPs)结合位点。外显子3编码α螺旋卷曲颈部区域；外显子4编码C-末端碳水化合物结合位点——MBL与病原体表面结合位点，此位点含有Ca2+结合位点。翻译成分子量25 340 Da的MBL原体，3条蛋白原体通过胶原结构域聚合形成同源三聚体，最终聚合形成各种多聚体。

MBL基因多态性MBL2基因多态性主要受种族影响，呈全球性分布；总体人群中大约外显子1区有5%的纯合子，30%的杂合子。

外显子1区第54位密码子的点突变为突变型B(GGC—GAC)，未发生突变为基因型A。第57、52位密码子分别为突变型C和突变型D(CGT—TGT)，并且将突变型B、C、D统一用“O”表示，即外显子有A/A、A/O、O/O三种基因型。启动子区域常见的有H/L、Y/X和未翻译区P/Q三种基因型。H/L和Y/X代表G—C，其中H、Y代表G,L、X代表C。MBL基因5′端未翻译区P代表C,Q代表T。H/L位于-550，Y/X位于-221，P/Q位于+4。

启动子区域和外显子1区多态性具有基因连锁不平衡，因此MBL的基因型并不是随机出现的。目前最常见的有7种(HYPA、LYQA 、LYPA、LXPA、HYPD、LYQC及LYPB)，H与P具有严格的相关性，X仅出现在LXPA，而LY与P/Q两者相关。

MBL蛋白结构和功能MBL主要在肝脏合成，血清中含量最高；炎症状态下MBL浓度升高，因此MBL是急性时相反应蛋白。MBL是凝集素家族中的一员，包括富含半胱氨酸的氨基末端、胶原样结构域、螺旋颈部结构和钙离子依赖性糖原识别结构(CRD)。

MBL有两个基本功能：在机体对病原体、异常自身组织的吞噬中发挥调节作用和激活补体系统。作为小模式识别分子(sPRM)， MBL不仅可识别病原体表面的D-甘露糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺(GlcNAc)和L-果糖与多种病原体结合，介导吞噬调节作用，而且能够识别凋亡细胞、细胞碎片和损伤组织中表达的内源性neoepitopes并与之结合[1,2]，在机体自身稳态中发挥作用。补体系统有三条激活途径：经典补体激活途径(CP)、MBL补体激活途径(LP)、旁路补体激活途径(AP)，最终都形成C3转化酶裂解C3，并形成C5转化酶裂解C5，C5b可以与C6、C7、C8、C9结合形成C5b-9复合物，即膜攻击复合物(MAC)，导致细胞裂解。补体C1q与抗原抗体免疫复合物结合，导致C1r裂解并激活，从而裂解并活化C1s，依次裂解C4、C2，形成C3转化酶(C4b2b)(图1A)；血循环中MBL与MASPs形成复合物，与配基结合后CRD构象改变激活MASPs，进而活化C2、C4，形成C3转化酶(C4b2a),启动MBL补体激活通路(图1B)；补体C3b与B因子结合，血清中D因子裂解结合态B因子形成Ba和C3bBb，C3bBb即为旁路途径C3转化酶。备解素(P因子)可以与C3bBb结合，并使之稳定(图1C)。

图1 三条补体激活途径示意图

MBL血清水平及其影响因素

正常人群中MBL的血清浓度0～10 μg/ml。来自不同人群的研究定义MBL缺陷的浓度水平亦不同，目前尚无统一的界定值。除受基因多态性的影响外，MBL血清水平还受检测方法和其他因素影响。

MBL2基因多态性影响MBL血清浓度主要受MBL2基因多态性影响，包括外显子、启动子区域。MBL基因多态性对浓度的影响HYPA=LYQA=LYPA>LXPA>>HYPD=LYPB=LYQC[3]。

MBL血清浓度与MBL2外显子基因型相关。对来自不同人群的1 642例健康人进行MBL血清浓度与A/0、A/A基因型相关性研究发现，整体上MBL血清浓度与基因型具有很好的相关性，但对个体而言MBL2基因型与MBL的血清浓度没有相关性[4]。事实上与某一特定基因型相对应的MBL血清浓度范围很大，根据MBL血清浓度来推测其基因型是不准确的，同样根据基因型来推测MBL血清浓度也不准确。

启动子区域的多态性也影响MBL血清浓度。一般情况下，HYPA 和LYQA代表MBL血清浓度偏高,LXPA代表浓度偏低，LYPA代表处于两者中间。当外显子A/A与启动子HY或LY组合时，MBL血清浓度通常>300 ng/ml，而与启动子LX组合时，正常人群中有超过10%的人MBL血清浓度<300 ng/ml。

MBL检测方法影响通常用ELISA方法检测MBL血清浓度，主要包括双抗体夹心法、MBL抗体捕获法和补体C4沉淀实验。由于检测抗体和检测方法不同，检测结果也差异甚大。

传统MBL检测方法都是检测A/A基因型表达蛋白，O/O基因型表达蛋白几乎无法检出或浓度极低[5]。然而应用其他方法，例如时间分辨免疫荧光分析 (TRIFMA)法对同样的患者进行检测发现，有的患者MBL浓度高达500 ng/ml应用MBL抗体捕获法检测亦可发现相同结果。以上方法只能对MBL进行定量检测，补体C4沉淀实验是常用MBL定量和功能活性检测方法[6]。我们认为应用此法检测MBL浓度与疾病的相关性最有意义。

其他除了基因型和检测方法可影响MBL血清浓度外，还有年龄、激素水平和机体免疫状态等。首先，MBL血清水平与年龄相关，出生后MBL血清浓度升高，一月后逐渐降低，至12周岁时与成人水平相当[7]，49岁后逐渐降低。其次，甲状腺激素(T3、T4)和生长激素(GH) 可以促进MBL的合成。在T3、T4和GH刺激下肝细胞HuH-7合成MBL明显增多[8]，甲状腺功能亢进患者在接受治疗后血清MBL浓度明显降低[9]。在感染或其他炎症性反应时MBL血清水平可升高2～3倍。

MBL在肾脏疾病中的作用

补体系统不仅是机体抵御病原体入侵的第一道防线，而且在机体免疫系统自稳中具有重要作用。因此免疫系统缺陷不仅与感染性疾病有关，而且与自身免疫性疾病和炎症性疾病有关。肾脏易受免疫系统损伤，其中补体系统在肾脏疾病的进展中具有重要作用，并且LP通路是重要补体活化通路之一。

MBL与IgA肾病(IgAN) IgAN是以肾小球系膜细胞增生和系膜区IgA沉积为特征的肾小球疾病，约50%的IgAN患者IgA血清浓度升高。IgAN患者IgA1分子重链铰链区半乳糖缺乏导致其特异性抗体产生，两者结合形成致病性IgA1免疫复合物沉积在肾小球系膜区，刺激系膜细胞增生[10]。

90%IgAN患者肾组织有C3沉积，备解素、C5和IgA分子也在系膜区共沉积，但是无C1q沉积，表明AP通路活化、而无CP通路活化。Onda等[11]发现IgAN患者具有高补体血症，与健康人相比IgAN患者血清CH50、C4、B因子和properdin浓度明显升高。或许患者本身的慢性炎症状态可导致补体成分浓度升高，但是C3和MBL血清浓度却相对减少，说明MBL和C3消耗增多导致其血清浓度相对降低，提示IgAN患者AP通路活化同时也有LP通路的激活。在部分IgAN肾组织可见C4沉积，血清中亦有C4活化产物[12,13]，说明LP通路活化参与IgAN进展。

IgAN患者体内LP通路的启动机制还不完全清楚,但存在以下可能。首先，可能通过MBL与含有糖基化异常的免疫复合物结合启动。IgAN患者血清铰链区半乳糖缺乏IgA1分子和特异性抗体形成大量致病性免疫复合可以激活血清中LP通路[10,14]，大量免疫复合物也可集聚到肾小球系膜区激活LP通路。其次，IgAN患者糖基化异常IgA分子易形成IgA多聚物[15]， MBL通过CRD识别从IgAN患者血清纯化的IgA多聚物，并与之结合活化LP通路[16]。然而糖基化异常IgA分子能否活化LP通路目前不清楚。因为MBL配基是甘露糖和GlcNAc，ficolins配基是GlcNAc，MBL和ficolins不能识别体内半乳糖和唾液酸。尽管IgAN患者糖基化异常的IgA1分子可与植物凝集素结合[17]，但是MBL和ficolins没有凝集素活性。

Endo等[18]首先发现25%的IgAN患者肾小球系膜区可见MBL/MASP-1沉积。Lhotta等[19]也发现27%的IgAN患者肾小球系膜区可见MBL沉积。最近Roos等[20]发现肾小球系膜区仅见IgA1沉积，且MBL沉积阳性的系膜区均可见L-ficolins和IgA1共沉积，表明MBL能够与沉积在系膜区含异常糖基化IgA1和(或)IgG复合物结合。Hisano等[21]研究显示53%的IgAN患者肾小球系膜区IgA1和IgA2沉积均阳性，所有患者均无C1q沉积。同时系膜区有IgA1和C3c沉积阳性者就无C4、MBL和MASP-1沉积，说明系膜区IgA1沉积导致AP通路活化；系膜区IgA1、IgA2、C3c、C4、MBL和MASP-1沉积均阳性的患者可见IgA2、MBL和MASP-1共沉积，说明系膜区IgA2沉积与LP通路活化有关。他们认为这与部分IgAN患者上呼吸道感染后出现严重血尿有关。病原体感染后IgAN患者体内IgA2产生增多，IgA2具有MBL结合位点，可与MBL/MASP-1结合形成IgA2-MBL/MASP-1复合物激活LP通路。此外肾小球固有细胞及凋亡细胞受损后，导致其内源性寡糖结构域暴露，MBL也可通过识别这些寡糖结构域从而启动LP。关于肾组织LP通路活化的启动目前还不清楚。

Endo等[18]研究表明与MBL/MASP-1沉积阴性相比，阳性者发病年龄早、活动性指数高。Roos等[20]也发现，与MBL沉积阳性的IgAN患者终末期肾病(ESRD)发生率增高(P<0.000 1)，蛋白尿更多(P<0.05)，镜下血尿严重(P<0.05)，血清肌酐水平高(P<0.05)，系膜增生、新月体形成、肾小球硬化和间质炎症浸润及纤维化等组织学损伤更重。因此LP通路的活化与肾脏损伤有关，是IgAN进展恶化的关键因素之一。在病理检查时应常规检测C4或C4裂解物(C4c、C4d)，若系膜区C4沉积提示预后不良[22]。然而，Hisano等[21]研究却发现有无MBL沉积与疾病临床和病理均无显著联系，但在他们的研究中有53%的IgAN患者系膜区可见IgA2沉积，而在Endo等[18]和Roos等[20]研究中所有患者均未见IgA2沉积。总之IgAN患者肾组织中有MBL沉积，说明有LP通路活化。

IgAN患者血清MBL浓度低者较浓度高者尿蛋白少、肾小球滤过率高，但无统计学意义。也有研究表明MBL基因多态性和MBL缺乏均与IgAN易感性和疾病严重程度无关[23]，可能与研究人群种族不同及标本数量有限有关。MBL浓度高低与IgAN发病及进展有无关系至今尚无定论。

IgAN患者血液循环和肾脏局部均有LP通路的活化，但是对于MBL配基—LP通路活化机制还需要进一步研究。

MBL与糖尿病肾病(DN) 补体系统与糖尿病(DM)患者心血管功能障碍有关，在DM患者体内发现有补体成分沉积。LP通路参与DM并发症的发生，血清MBL浓度升高与DN、心血管疾病和死亡率升高有关。

多种因素导致DN发生，其中低浓度的炎症状态和补体系统的激活参与疾病的进展。补体系统通过膜攻击复合物(MAC)和过敏毒素(C3a、C5a)引起炎症反应，参与机体损伤。在DN肾组织中发现MAC沉积增多[24]，且最近发现糖基化介导的局部补体系统的激活在DN进展中具有重要作用[25]。

MBL可能通过高糖血症和LP两条途径参与DM疾病的进展，但是具体机制目前还不清楚。DM患者体内糖基化作用加强，血清中糖基化蛋白增多，有可能激活补体系统。Fortpied等[26]研究表明果糖赖氨酸、甘露糖能够与血清MBL竞争结合，MBL 与果糖赖氨酸结合后激活补体系统，由此推测LP通路激活参与DM并发症发生。

MBL敲除小鼠体内LP通路不能激活、DN肾脏损伤减轻，表明在DN中LP具有重要作用。MBL基因虽然不是1型DM的易感基因，但是1型DM患者体内MBL血清水平明显升高，且MBL血清浓度和基因型与微量白蛋白尿和DN的发生、进展有关[27]。2型DN患者MBL血清浓度与健康对照无显著差异，但是血清MBL可预测2型DN患者远期预后。

MBL和缺血再灌注性肾损伤(I/R) I/R是急性肾损伤的主要原因之一，也是影响移植肾远期预后的关键因素。补体系统参与I/R,其中LP补体激活通路具有重要作用。氧化应激损伤时，MBL与内皮细胞结合，加入人类血清后出现C3沉积;在敲除MBL基因的小鼠模型中I/R明显减轻。

MBL在小鼠I/R模型早期肾小管上皮细胞明显沉积，与后期C6沉积部位相同，说明在小鼠肾损伤模型中有LP通路的活化[28]；并且MBL沉积程度与灌注后期补体活化、中性粒细胞聚集和(或)器官衰竭有关。Meprins α和β是位于近端肾小管高度糖基化金属蛋白酶，是内源性MBL配基[29]。Hirano等[30]研究发现小鼠I/R时MBL、C3b和meprins在肾脏皮髓质共定位，MBL与meprins结合启动LP通路[30]。

最近研究发现MBL不但通过补体激活通路参加I/R，且能直接损伤肾小管上皮细胞，导致上皮细胞凋亡。van der Pol等[31]发现在补体活化之前，大鼠肾缺血再灌注损伤早期MBL就可以介导肾小管上皮细胞损伤，抑制补体活化后并未减轻损伤，而且体外培养的人小管上皮细胞易受到MBL细胞毒性损伤。

LP通路和MBL本身都参与I/R，降低MBL血清浓度能够减轻肾小管损伤、中性粒细胞和巨噬细胞聚集、促炎因子和趋化因子释放，有利于保护肾功能。因此降低血清MBL浓度，可减轻I/R,改善移植肾的远期预后。

MBL与狼疮性肾炎(LN) 系统性红斑狼疮(SLE)是典型的累及多系统、多器官的自身免疫性疾病。LN是SLE最为严重的并发症之一，是预后不良的重要因素。大量研究表明SLE易感性与MBL功能缺陷有关，也有少量研究显示无统计学意义。血清MBL缺乏与SLE临床表现、心血管和感染等并发症有关[32]。与对照组相比，LN组MBL血清浓度明显降低，且与MBL基因启动子LX型增加相关[33]。

MBL在SLE、LN中的作用至今未明。低浓度MBL致使SLE患者易受病原体侵袭，激活潜在的免疫系统紊乱，导致疾病的易感性增强,然而MBL却参与肾脏组织损伤。MRL-lpr LN小鼠模型中有C3和MBL沉积，说明LP通路参与LN肾损伤[34]。LN患者肾活检组织中也有MBL/L-ficolin沉积，沉积阳性者尿蛋白明显比阴性者更多[35]。肾组织Annexin V阳性的LN患者，大多数都有MBL、L-ficolin和备解素沉积且共定位[35]。我们推测可能间接通过LP通路，或者直接通过TLR信号转导通路参与肾脏损伤[31,36]。

小结：MBL基因多态性影响MBL血清浓度和功能活性与多种疾病有关。肾脏易受免疫系统损害，补体在多种肾脏疾病损伤中发挥作用。血清MBL在肾脏组织沉积，激活补体和促炎症因子产生导致肾脏损伤，同时在炎症刺激下肾脏固有细胞和浸润炎症细胞可能分泌MBL,直接或间接加重肾损伤。在基因突变的患者，具有功能活性的MBL浓度降低，不仅自身免疫力下降，且对正常凋亡细胞清除能力下降，导致自身抗体不断产生，机体稳态被打破；无功能的MBL相对增多，是否通过非补体激活途径参与肾组织损伤，目前尚无相关研究。对于MBL介导的肾脏损伤机制还需要进一步研究。

1 Takahashi K,Ip WE,Michelow IC,et al.The mannose-binding lectin:a prototypic pattern recognition molecule.Curr Opin Immunol,2006,18(1):16-23.

2 Takahashi K,Ezekowitz RA.The role of the mannose-binding lectin in innate immunity.Clin Infect Dis,2005,41(Suppl 7):S440-444.

3 Boldt AB,Messias-Reason IJ,Meyer D,et al.Phylogenetic nomenclature and evolution of mannose-binding lectin (MBL2) haplotypes.BMC Genetics,2010,11:38.

4 Eisen DP,Dean MM,Boermeester MA,et al.Low serum mannose-binding lectin level increases the risk of death due to pneumococcal infection.Clin Infect Dis,2008,47 (4):510-516.

5 Frederiksen PD,Thiel S,Jensen L,et al.Quantification of mannan-binding lectin.J Immunol Methods,2009,315 (1-2):49-60.

6 Minchinton RM,Dean MM,Clark TR,et al.Analysis of the relationship between mannose-binding lectin (MBL) genotype,MBL levels and function in an Australian blood donor population.Scand J Immunol,2002,56(6):630-641.

7 Sallenbach S,Thiel S,Aebi C,et al.Serum concentrations of lectin-pathway components in healthy neonates,children and adults:mannan-binding lectin (MBL),M-,L-,and H-ficolin,and MBL-associated serine protease-2 (MASP-2).Pediatr Allergy Immunol,2011,22 (4):424-430.

8 Sørensen CM,Hansen TK,Steffensen R,et al.Hormonal regulation of mannan-binding lectin synthesis in hepatocytes.Clin Exp Immunol,2006,145 (1):173-182.

9 Riis AL,Hansen TK,Thiel S,et al.Thyroid hormone increases mannan-binding lectin levels.Eur J Endocrinol,2005,153(5):643-649.

10 Suzuki H,Kiryluk K,Novak J,et al.The pathophysiology of IgA nephropathy.J Am Soc Nephrol,2011,22(10):1795-1803.

11 Onda K,Ohi H,Tamano M,et al.Hypercomplementemia in adult patients with IgA nephropathy.J Clin Lab Anal,2007,21(2):77-84.

12 Wyatt RJ,Kanayama Y,Julian BA,et al.Complement activation in IgA nephropathy.Kidney Int,1987,31(4):1019-1023.

13 Miyazaki R,Kuroda M,Akiyama T,et al.Glomerular deposition and serum levels of complement control proteins in patients with IgA nephropathy.Clin Nephrol,1984,21(6):335-340.

14 Glassock RJ.The pathogenesis of IgA nephropathy.Current Opinion in Nephrology and Hypertension,2011,20(2):153-160.

15 Kokubo T,Hiki Y,Iwase H,et al.Protective role of IgA1 glycans against IgA1 self-aggregation and adhesion to extracellular matrix proteins.J Am Soc Nephrol,1998,9( 11):2048-2054.

16 Roos A,Bouwman LH,van Gijlswijk-Janssen DJ,et al.Human IgA activates the complement system via the mannan-binding lectin pathway.J Immunol,2011,167(5):2861-2868.

17 Coppo R,Amore A.Aberrant glycosylation in IgA nephropathy (IgAN).Kidney Int,2004,65(5):1544-1547.

18 Endo M,Ohi H,Ohsawa I,et al.Glomerular deposition of mannose-binding lectin (MBL) indicates a novel mechanism of complement activation in IgA nephropathy.Nephrol Dial Transplant,1998,13(8):1984-1990.

19 Lhotta K,Würzner R,König P.Glomerular deposition of mannose-binding lectin in human glomerulonephritis.Nephrol Dial Transplant,1999,14(4):881-886.

20 Roos A,Rastaldi MP,Calvaresi N,et al.Glomerular activation of the lectin pathway of complement in IgA nephropathy is associated with more severe renal disease.J Am Soc Nephrol,2006,17(6):1724-1734.

21 Hisano S,Matsushita M,Fujita T,et al.Mesangial IgA2 deposits and lectin pathway-mediated complement activation in IgA glomerulonephritis.Am J Kidney Dis,2001,38(5):1082-1088.

22 Espinosa M,Ortega R,Gómez-Carrasco JM,et al.Mesangial C4d deposition:a new prognostic factor in IgA nephropathy.Nephrol Dial Transplant,2009,24(3):886-891.

23 Pirulli D,Boniotto M,Vatta L,et al.Polymorphisms in the promoter region and at codon 54 of the MBL2 gene are not associated with IgA nephropathy.Nephrol Dial Transplant,2001,16(4):759-764.

24 Qin X,Goldfine A,Krumrei N,et al.Glycation inactivation of the complement regulatory protein CD59:a possible role in the pathogenesis of the vascular complications of human diabetes.Diabetes,2004,53(10):2653-2661.

25 Uesugi N,Sakata N,Nangaku M,et al.Possible mechanism for medial smooth muscle cell injury in diabetic nephropathy:glycoxidation-mediated local complement activation.Am J Kidney Dis,2004,44(2):224-238.

26 Fortpied J,Vertommen D,Van Schaftingen E.Binding of mannose-binding lectin to fructosamines:a potential link between hyperglycaemia and complement activation in diabetes.Diabetes Metab Res Rev,2010,26(4):254-260.

27 Hansen TK,Forsblom C,Saraheimo M,et al.Association between mannose-binding lectin,high-sensitivity C-reactive protein and the progression of diabetic nephropathy in type 1 diabetes.Diabetologia,2010,53(7):1517-1524.

28 de Vries B,Walter SJ,Peutz-Kootstra CJ,et al.The mannose-binding lectin-pathway is involved in complement activation in the course of renal ischemia-reperfusion injury.Am J Pathol,2004,165(5):1677-1688.

29 Hirano M,Ma BY,Kawasaki N,et al.Mannan-binding protein blocks the activation of metalloproteases meprin alpha and beta.J Immunol,2005,175(5):3177-3185.

30 Hirano M,Ma BY,Kawasaki N,et al.Role of interaction of mannan-binding protein with meprins at the initial step of complement activation in ischemia/reperfusion injury to mouse kidney.Glycobiology,2012,22 (1):84-95.

31 van der Pol P,Schlagwein N,van Gijlswijk DJ,et al.Mannan-binding lectin mediates renal ischemia/reperfusion injury independent of complement activation.Am J Transplant,2012,12(4):877-887.

32 Monticielo OA,Mucenic T,Xavier RM,et al.The role of mannose-binding lectin in systemic lupus erythematosus.Clin Rheumatol,2008,27 (4):413-419.

33 王艾丽,周春红,马玉茜,等.MBL基因多态性及血清MBL浓度与狼疮性肾炎的关系.临床检验杂志,2007,25(5):327-329.

34 Trouw LA,Seelen MA,Duijs JM,et al.Activation of the lectin pathway in murine lupus nephritis.Mol Immunol,2005,42(6):731-740.

35 Sato N,Ohsawa I,Nagamachi S,et al.Significance of glomerular activation of the alternative pathway and lectin pathway in lupus nephritis.Lupus,2011,20(13):1378-1386.

36 Wang M,Chen Y,Zhang Y,et al.Mannan-binding lectin directly interacts with Toll-like receptor 4 and suppresses lipopolysaccharide-induced inflammatory cytokine secretion from THP-1 cells.Cell Mol Immunol,2011,8(3):265-275.