小拟南芥液泡膜H＋－PPase基因OpVP1的克隆、序列分析及表达

徐芳，赵云霞，魏艳玲，李超，孙黎，黄先忠

（石河子大学生命科学学院农业生物技术重点实验室，石河子 832003）

盐胁迫是导致农作物减产的主要非生物因素之一，土壤中过高浓度的Na＋会造成植物的生理干旱，扰乱细胞的离子平衡，导致膜功能失调和代谢活动的减弱，从而抑制生长并最终导致细胞死亡［1］。植物细胞抵御Na＋毒害的主要策略有Na＋的外排和Na＋的区域化［2］。这2个过程分别由分布在质膜和液泡膜上的Na＋／H＋逆向转运蛋白实现。已有研究表明，液泡膜Na＋／H＋逆向转运蛋白在液泡膜H＋－ATPase和液泡膜H＋－PPase建立的跨液泡膜质子梯度的驱动下，将细胞质中过多的Na＋区域化到液泡内，从而减轻了Na＋对细胞质内的各类代谢酶的危害，同时降低了细胞渗透势，进而提高植物的耐盐性和抗旱性［3－4］。

液泡膜H＋－PPase是一种广泛存在于很多生物体内的H＋转运酶。它只包含1条分子量约80kDa的多肽，结构简单，其底物为简单的低价焦磷酸（PPi），含有1个高能磷酸酐键［5］。在植物对水分胁迫和盐分胁迫的响应中，H＋－PPase作为一种有效的质子泵调节细胞的酸度，驱动各种离子在液泡内的区隔化，扮演着重要的角色。液泡膜H＋转运无机焦磷酸酶水解2个无机磷（Pi）的同时，还能将H＋从细胞质经过液泡泵入膜内，起到质子泵的作用，即将PPi水解的自由能与质子跨膜转运相偶联，形成质子驱动力（△H＋），为离子和其它溶质的次级转运提供动力［5］。在植物细胞中，H＋－PPase除了作为一种有效的质子泵调节细胞的酸度，驱动各种离子在液泡内的区隔化外，还可作为一种调节因子控制植物生长素的运输，在植物响应逆境胁迫和调节植物生长发育的过程中可能起作用［6］。近年来，人们对植物耐盐的分子机制的研究已经取得了较大的进展。但是，植物的耐盐性是一个复杂的问题，还存在很多的问题需要进一步的阐明。所以，对植物耐盐性的进一步探索，还需从更多的盐生植物着手，挖掘耐盐相关基因，才能真正从细胞、组织和整体水平上阐明植物盐胁迫的信号转导机制，为植物的遗传改良奠定基础。

小拟南芥为十字花科无苞芥属早春短命植物，异种名是Arabidopsis pumila，现在的接受名是Olimarabidopsis pumila，是模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）的近缘种［7］。小拟南芥在新疆分布较为广泛，适应新疆特殊的干旱气候，具有生活周期短、光合效率高、结实量大的特点［8］。近年来对小拟南芥耐盐生物学特性进行初步的研究，发现小拟南芥适应于新疆特殊环境，具有耐受高浓度NaCl胁迫的特性［9，10］。小拟南芥是植物生物学研究较好的材料，可以利用它研究平行进化的同源基因和进化中产生的新基因。近年来，我们一直以小拟南芥为研究材料，克隆了Na＋／H＋逆向转运蛋白相关基因ApNHX1［10］，构建了小拟南芥经高盐胁迫的入门cDNA文库［11］。本研究通过同源克隆的方法试图从小拟南芥克隆1个液泡膜H＋－PPase逆向转运蛋白基因cDNA全长序列，并利用一系列生物信息学软件分析了该蛋白的理化性质、结构域、跨膜特性、系统进化等，旨在为进一步研究该基因的功能打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

新疆小拟南芥（Olimarabidopsis pumila）种子为本实验室保存，小拟南芥的室内培养参照文献［10］中的方法进行。

大肠杆菌菌株 DH5α、质粒pCAMBIA2300－CaMV35S由本实验室保存，质粒pMD18－T vector、DNA Marker、限制性内切酶、Taq酶、IPTG、X－gal、DEPC购自TaKaRa公司，SMARTTM RACE cDNA Amplificatin Kit购自Clontech公司，凝胶回收试剂盒购自Promega公司，其它试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 新疆小拟南芥RNA的提取和cDNA的合成

小拟南芥根、茎、叶片、花和角果等组织总RNA的提取采用TIANGEN公司的RNA prep pure Plant Kit试剂盒（离心柱型），参照说明书提取。cDNA模板第一链的制备，根据Promega公司MMLV Reverse Transcriptase合成。

1.2.2 OpVP1基因核心片段的扩增

根据NCBI上登录的液泡膜H＋－PPase基因的保守序列设计扩增核心序列的1对引物：

P1：5′－GACCAGAGTGTTGTGGCTAA－3′；P2：5′－ATGTGGCGTAGTCAGGTT－3′。

以上面制备的叶片cDNA为模板，P1，P2为引物进行PCR扩增。

RT－PCR扩增体系为20μL：cDNA 3μL，10×Ex Taq Buffer 2.0μL，2.5mmol／L dNTP Mixture 1.5μL，10μmol／L的上下游引物各0.5μL，Ex Taq（5U／μL）0.2μL。

扩增条件：94℃2min后；94℃30s，56℃30 s，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min。

PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，凝胶回收试剂盒回收目的片段。将目的片段连接到pMD 18－T载体上，转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性克隆于LB培养基中过夜摇菌，小量提取质粒经酶切鉴定，将鉴定正确的质粒交由北京六合华大基因科技股份有限公司测序。

1.2.3 OpVP1的3′RACE和5′RACE扩增

根据OpVP1基因的核心片段序列，分别设计3′RACE和5′RACE引物各2个。

3′RACE引物OpVP－3－GSP1：5′－TTCGCAGGCAGTTCAACACCATC－3′；

OpVP－3－GSP2：5′－GATTCCTCCTGGTTGCC TTGTCA－3′。

5′RACE引物OpVP－5－GSP1：5′－CAGAGGTAACAGCACCAAGAACG－3′；

OpVP－5－GSP：5′－GTGCTGAATCCCTCAAC AGAGCC－3′。

RACE反应体系和扩增条件均按照SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit说明书进行。

1.2.4 OpVP1基因开放阅读框（ORF）的扩增

根据核心片段序列、3′RACE和5′RACE扩增序列，拼接得到OpVP1基因全长cDNA序列，利用ORF Finder（www.ncbi.nlm.nih.gov／gorf／gorf.html）寻找ORF，根据最长的ORF设计1对引物：

Bam HⅠ－OpVP1－F：5′－CGGGATCCATGGTGGCGACAGCTTTACTACCGG－3′（下划线代表Bam HⅠ酶切位点）；

XbaⅠ－OpVP1－R：5′－GCTCTAGATTAGAGGTACTTGAAAAGGATACC－3′（下划线代表XbaⅠ酶切位点），用作OpVP1基因ORF的扩增。

扩增体系为20μL：cDNA 3μL，10×Ex Taq Buffer 2.0μL，2.5mmol／L dNTP Mixture 1.5 μL，10μmol／L的上下游引物各0.5μL，Ex Taq（5U／μL）0.2μL。

扩增条件：94℃2min；94℃45s，58℃45s，72℃3min，35个循环；72℃10min。

目的片段的检测和测序同1.2.2。这样构建了pMD 18－T：OpVP1载体。

1.2.5 生物信息学分析

蛋白理化性质预测用ProtParam （http：／／www.expasy.ch／tools／protparam.html）分析；疏水性／亲水性分析用ProtScale （http：／／expasy.org／tools／protscale.html）分析；跨膜结构预测用TMHMM－2.0 （http：／／www.cbs.dut.dk／services／TMHMM－2.0／）；蛋白质的三级结构预测使用Swiss－Model workspace （http：／／swissmodel.expasy.org／）进行同源建模［12］，并用 Swiss－Pdb Viewer 4.1.0进行可视化分析。

在 NCBI（http：／／www.ncbi.nlm.nih.gov）中下载相关的VP蛋白序列，利用MEGA4.1（Molec－ular Evolutionary Genetics Analysis，version4.1）软件进行部分已知VP蛋白的系统进化分析，蛋白序列比对利用Clustal W程序进行，进化树利用Neighbor－Joining方法构建，其中进行1000次Bootstrap分析以使得分枝的结果更可靠［13］。

1.2.6 OpVP1基因组织表达分析

采用实时荧光定量PCR（qRT－PCR）技术分析OpVP1在小拟南芥不同组织中的表达。

基因特异上游引物：5′－GCCTGGGACAACGCCAAGAAGTA－3′；

下游引物和5′－CACCGTGAGTGGCAAAGA A GGGA－3′。

内参引物采用Actin2引物，分别为Actin2－F：5′－GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG－3′；Actin2－R：5′－AACGACCTTAATCTTCATGCTGC－3′扩增。

qRT－PCR反应体系和反应程序参照TaKaRa公司产品SYBR○RPremix Ex TaqTM（Perfect Real Time）的试剂说明书的方法进行。PCR仪为罗氏Light Cycler○R480Real－Time PCR System 荧 光定量PCR仪，检测每份样品的OpVP1基因和Acitin2内参基因Ct值，每份样品3次重复。实验数据分析采用2－△Ct法进行相对定量分析，先分别计算出每组的△Ct＝Ct目的基因－Ct内参基因，再根据△Ct求出2－△Ct以及标准误。使用Microsoft Excel 2007软件处理数据并作图。

2 结果与分析

2.1 小拟南芥液泡膜H＋－PPase基因全长的克隆

以小拟南芥的叶片cDNA为模板，利用保守引物扩增得到1条约为1600bp的核心片段（图1－1）。将该片段克隆、测序，Blast X比对分析，发现该序列与拟南芥的AVP1（NM＿101437.4）氨基酸相似性为94%，表明该序列可能为小拟南芥质子焦磷酸酶基因。通过3′RACE扩增得到700bp的3′端cDNA序列（图1－2），通过5′RACE扩增得到620bp的5′端cDNA序列（图1－3）。将3个片段拼接起来得到一全长的cDNA序列，可预测得到最长的ORF。根据该ORF序列设计扩增引物，扩增得到1个2.3kb的cDNA序列（图1－4）。

测序结果与拼接的编码序列完全吻合。这表明扩增了该基因的ORF序列，并将该基因命名为OpVP1。

图1 小拟南芥OpVP1基因的PCR扩增Fig.1 PCR amplification of gene OpVP1in Olimarabidopsis pumila

2.2 OpVP1基因的生物信息学分析

OpVP1基因的cDNA全长为2698bp，含有2313bp的完整ORF，推测编码770个氨基酸。氨基酸序列比对分析结果表明，OpVP1同拟南芥的AVP1（AAL84953）、琴叶拟南芥 AlVP1 （XP＿0028901200）、芜菁的BrVP1（AET95910）的相似性最高，分别为98.4%、98.6%和95.3%。其与盐芥TsVP1（AAR08913）、棉花GhVP1（ADN96173）的相似性分别为96.2%、89.1% （图2）。

图2 OpVP1同其他植物的H＋－PPase蛋白氨基酸序列比对分析Fig.2 Alignment analysis of OpVP1and H＋－PPase from other plants

ProtParam分析软件推测OpVP1蛋白的分子式为C3688H5780N900O1058S34，相对分子量是80745.9Da，等电点pI 5.13。

用TMHMM－2.0预测表明OpVP1蛋白具有14个跨膜结构（图3）。利用Swiss－Model workspace进行OpVP1蛋白的同源建模（图4），表明该蛋白的三维结构是由2个相同的单体组成的蛋白质二聚体，每个单体含有26个α－螺旋和5个β－折叠。其中，α－螺旋占整个氨基酸序列的75%左右，并且像栅栏似的平行排列，说明该蛋白具有膜蛋白的特点。

将来自不同植物的液泡膜H＋－PPase基因的氨基酸序列构建系统进化树分析（图5）。表明植物的H＋－PPase基因同源基因按照单子叶和双子叶分别进化。小拟南芥OpVP1基因与琴叶拟南芥、拟南芥、芜菁、盐芥等H＋－PPase基因遗传距离最近，属于Ⅰ型液泡膜H＋－PPase基因。

图3 OpVP1蛋白的跨膜结构预测Fig.3 Transmembrane region prediction of OpVP1

图4 OpVP1的三级结构Fig.4 Tertiary structure of OpVP1

图5 植物液泡膜H＋－PPase基因的系统进化树Fig.5 Phylogentic tree of vacuole H＋ －PPase gene from different plants

2.3 OpVP1基因的组织表达分析

qRT－PCR实验结果（图6）表明，OpVP1基因在小拟南芥的根、茎、叶、花、果荚中均有表达，在角果中的表达最高，其次是在花中的表达，茎和叶片中的表达量相似，根中的表达最低。

图6 qRT－PCR分析OpVP1基因的组织表达Fig.6 Expression analysis of OpVP1in different tissue of Olimarabidopsis pumila by qRT－PCR

3 讨论与结论

植物液泡膜H＋－PPase在植物的耐盐中起着作用［2－4］。通 过 RT－PCR 和 RACE 技术，从新疆 短命耐盐植物小拟南芥中克隆了1个液泡膜H＋－PPase基因OpVP1，OpVP1基因的cDNA全长为2698 bp，5′非编码区（UTR）长度为178bp，3′非编码区（UTR）长度为206bp，ORF长2313bp，推测该基因编码770个氨基酸。OpVP1蛋白的分子量约80 KDa，等电点pI 5.13。三级结构预测表明OpVP1是由2个相同的单体组成的蛋白质二聚体，每个单体主要以α－螺旋为主。

高等植物中存在Ⅰ型和Ⅱ型2种类型的液泡膜H＋－PPase，Ⅰ型依赖K＋激活而适度被Ca2＋激活，主要分布在液泡膜上，Ⅱ型对K＋不敏感而对Ca2＋极其敏感，主要分布在高尔基体和溶酶体上［14－15］。这2种类型的H＋－PPase在氨基酸序列上亲缘关系较远，它们之间的同源性仅有37%～39%［16］。本研究克隆的小拟南芥H＋－PPase基因OpVP1与模式植物拟南芥Ⅰ型H＋－PPase基因AVP1的同源性为98.2%，而与Ⅱ型H＋－PPase基因AVP2的同源性仅为40%，系统进化分析也表明OpVP1属于Ⅰ型H＋－PPase基因。

基因表达分析结果表明OpVP1基因在根、茎、叶、花和果实中都有表达，但在果实中的表达比其它组织中的表达量高。已有的研究表明H＋－PPase基因在不同植物的不同组织中表达量不相同，可能在植物在长期的进化中H＋－PPase基因的功能发生了分歧。番茄的Ⅰ型的H＋－PPase基因SlVP1在果实早期发育中起着重要作用［16］。

后期拟进行OpVP1基因的反式作用因子和顺式作用元件的分析。我们的研究将进一步解析植物H＋－PPase基因家族如何行使功能的，丰富植物耐盐信号传导的分子机制。

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