多花黑麦草绿汁发酵液中乳酸菌的分离鉴定

李 季，杨春华，贾露洁，梁 欢，郭丽娟，刘 羽，李攀峰

(四川农业大学动物科技学院，四川 雅安 625000)

多花黑麦草(Loliummultiflorum)是禾本科黑麦属越年生牧草，其草质优良，柔嫩多汁，适口性好，是草食家畜的优良饲料[1-2]。但其季节性较强，在生长旺盛的季节，南方地区多雨水天气，不宜调制干草，所以青贮是保存南方牧草的最佳方法[3]。青贮是一种很好的饲料利用方式，可通过乳酸菌的增殖，将原料中的可溶性糖转化为乳酸类物质，创造酸性环境，抑制有害微生物的增殖，从而保存青贮饲料中的养分，达到饲料长期贮存的目的。但由于自然青贮效果较差，目前多向青贮原料中加入添加剂以促进发酵，而乳酸菌添加剂又被认为是其中的一种安全、无污染、低成本添加剂。绿汁发酵液作为一种天然的添加剂在一些试验中被验证其添加效果优于市面上的乳酸菌添加剂，但其不易储存，运输困难需现用现制，难以实现商品化[4]。因此，从绿汁发酵液中分离鉴定起主要作用的菌株便有较为重要的意义[5-7]。本研究以长江2号多花黑麦草为原料，分离、鉴定多花黑麦草绿汁发酵液中起主要作用的乳酸菌种类，观察其作为添加剂对多花黑麦草青贮品质的影响，并选育出优良菌株，研发出相应的乳酸菌添加剂并进行推广利用。

1 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1植物材料 四川农业大学教学科研园区的长江2号多花黑麦草。

1.1.2试剂 结晶紫染色液、碘液、复红乙醇溶液、80%的无菌甘油、TE缓冲液、10%SDS、20 mg·mL-1蛋白酶K、10 mol·L-1CTAB、5 mol·L-1NaCl、酚/氯仿/异戊醇试剂、氯仿/异戊醇试剂、异丙醇、70%乙醇、灭菌去离子水和溴化乙锭。

1.1.3培养基 采用MRS固体、液体和半固体培养基。液体培养基不加琼脂，半固体培养基琼脂含量为4 g·L-1，固体培养基琼脂含量为20 g·L-1，各种培养基在高压灭菌前均调节pH至6.2～6.8。

1.1.4仪器设备 高压灭菌锅、超净工作台、恒温水浴锅、高速离心机、振荡培养箱、电子显微镜、粉碎机、紫外分光光度计、电子天平、恒温水浴槽、凝胶成像分析系统、电热恒温培养箱、高速冷冻离心机、梯度基因扩增仪、电泳仪、酸度计和分光光度计。

1.2试验方法

1.2.1绿汁发酵液的调制 将新鲜的多花黑麦草剪碎，加入2倍质量的灭菌蒸馏水，用粉碎机粉碎1 min后用两层纱布过滤，加入20 g·L-1的葡萄糖，分装于100 mL的容量瓶中密封，放入30 ℃恒温箱中厌氧培养48 h[8]。

1.2.2乳酸菌的分离纯化及保存 在超净工作台上用接种环蘸取发酵好的绿汁发酵液，在配置好的MRS培养基上划线，然后将培养基密封放置于37 ℃恒温培养箱中培养1～2 d[9]。同时采用试管斜面培养法和无菌甘油保存法保存菌种[10]。

1.2.3菌种的生理生化鉴定 菌种鉴定先采用生理生化鉴定的方法来初步确定分离菌株的名称。生理生化鉴定根据凌代文和东秀珠[11]的方法，通过不同乳酸菌的显色反应来初步确定该种乳酸菌的名称。

1.2.4乳酸菌产酸能力的测定 将鉴定出的菌株分别接种至pH值为6.2的MRS液体培养基，置于30 ℃培养箱中培养48 h，通过测定pH值来判断乳酸菌的产酸能力[12]。

1.2.5乳酸菌的耐酸试验 将鉴定出的菌株分别接种至pH值为3.0的MRS液体培养基，置于30 ℃培养箱中培养48 h，在660 nm下测定菌液的吸光值，判断乳酸菌生长情况，从而推断其耐酸能力[13]。

1.2.6乳酸菌的耐盐试验 将鉴定出的菌株分别接种至NaCl浓度为5%、7%、8%、9%和10%的MRS培养基中，培养2～5 d后，测定乳酸菌的耐盐能力[14]。

1.3菌种的分子鉴定 最后用分子手段对这几种菌进行最终鉴定。分子手段步骤为用DNA试剂盒提取该菌的DNA，在微量紫外分光光度计下检测DNA纯度，之后对乳酸菌的16S rDNA进行PCR扩增，扩增结束后取扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，若观察到约1 500 bp的条带，则说明扩增成功。扩增成功的PCR产物由生物科技公司测序。测得16S rDNA序列后，在NCBI上用BLAST程序比对，从GenBank数据库中获得有关菌种的公认标准序列数据，并用PHYLIP软件包以Neighbor Join法绘制系统发育树。若序列同源性大于97.5%，则可确定该种菌株[5]。

2 结果与分析

2.1乳酸菌的分离筛选结果 从试验材料多花黑麦草的绿汁发酵液中分离出菌株若干，从中挑选革兰氏染色为阳性，形态整齐，有代表性的菌株若干(图1)，进行生理生化鉴定。

图1 绿汁发酵液革兰氏染色镜检Fig.1 Gram staining microscopic examination for Previously Fermented Juice of Italian ryegrass

2.2乳酸菌生理生化法鉴定结果 通过生理生化法，分离鉴定出10株不同乳酸菌。其中，乳酸杆菌两株，分别编号为L-1、L-2；乳酸球菌8株，分别编号L-3、L-4、L-5、L-6、L-7、L-8、L-9和L-10(表1)。

2.3乳酸菌产酸能力的测定 初步鉴定所得10株菌均能在48 h内将pH值降为3.4以下，都具有良好的产酸能力，是良好的青贮菌种(表2)。

2.4乳酸菌的耐酸试验 通过乳酸菌耐酸试验，初步筛选所得10株菌在pH值为3.0的培养基上均能正常生长，OD660 nm值都大于1.0，可知其繁殖速度较快，有利于青贮时快速繁殖出大量乳酸菌，促进发酵(表3)。

由于生理生化法无法十分准确鉴定出乳酸菌的确切名称，所以将上述10株菌送往生物科技公司进行进一步的分子手段鉴定，即16S rDNA序列同源性分析。

2.5乳酸菌的耐盐试验 通过耐盐性试验的测定，初步筛选出的10株菌在5%的NaCl环境下生长状况良好；在7%的环境下生长较正常，特别是4 d时菌株生长较好；在8%的环境下部分菌株出现生长较弱的情况；在9%和10%的环境下10株菌株都不能生长。可知所有菌株均可耐受8%的盐浓度(表4)。

表1 10株菌株的碳水化合物发酵产酸试验Table 1 Sugar fermentation test of 10 strains of lactic acid bacteria

表2 10株菌株的产酸能力测定Table 2 Acid production rate of 10 strains

表3 10株菌株的耐酸试验Table 3 Acid tolerance of 10 strains

表4 10株菌的耐盐试验Table 4 Salt tolerance of 10 strains of lactic acid bacteria

2.6分子手段鉴定结果

2.6.1PCR扩增结果 对乳酸菌的16S rDNA进行PCR扩增，扩增结束后取扩增产物在琼脂糖凝胶上电泳，均观察到约1 500 bp的条带(图2)，说明扩增成功。

2.6.2最终测序结果 测得16S rDNA序列后，在NCBI上用BLAST程序比对，从GenBank数据库中获得有关种的公认标准序列数据，最终确定6株菌种名称(表4)。

图2 PCR扩增结果Fig.2 The results of PCR amplifying

表5 6株菌的分子鉴定Table 5 Molecular identification of 6 strains of lactic acid bacteria

3 讨论与结论

乳酸菌在青贮发酵过程中起着至关重要的作用，其种类不同，作用的大小也有所不同。16S rDNA具有功能与进化上的同源性，其序列进化变异频率缓慢，在结构上极具保守性，且分子大小适中，携带着充足的生物信息。因此，16S rDNA序列分析法已成为一种鉴定微生种类的标准方法[14-16]。本研究运用MRS培养基分离培养长江2号多花黑麦草绿汁发酵液中的乳酸菌，并采用传统生理生化鉴定法初步鉴定出10株菌株，最终根据16S rDNA序列分析法确定10株菌株中有重复，实际鉴定菌株为6株。其中含1种乳酸杆菌：植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，5种乳酸球菌：乳酸球菌(L.garvieae)、乳酸乳球菌(L.lactis)、魏氏菌(Weissellaconfusa)、魏氏菌(W.cibaria)和乳酸明串珠菌(Leuconostoclactis)。6株菌全为同型发酵乳酸菌，都具有较强的产酸性、耐酸性和耐盐性。在青贮中，需要添加能迅速降低pH值以达到抑制有害菌生长，长期保存饲料营养的菌株[17]，以上6种菌具备上述条件，可作为制作多花黑麦草青贮的良好添加剂，用以提高其青贮品质，拥有较高的利用价值。但张涛等[18]通过不同发酵类型的乳酸菌制剂对青贮的品质影响的研究表明，异型发酵乳酸菌对青贮的有氧稳定性有明显的提升作用，应用时可混合添加。

刘晗璐[10]对牧草青贮品质的研究表明，添加乳酸菌可以改善试验牧草青贮发酵品质，其中球菌加杆菌组合处理组对牧草青贮品质改善效果最优，可将鉴定出的菌株按不同比例球菌加杆菌搭配组合添加至青贮中，研究其在实际青贮过程中对多花黑麦草青贮发酵品质的影响。

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