基于454焦磷酸测序法的典型草原土壤真核生物多样性

井赵斌，程积民，2，张宝泉，李红红

(1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌712100； 2.中国科学院水利部水土保持研究所，陕西 杨凌 712100；3.西北农林科技大学资源与环境学院，陕西 杨凌712100)

在陆地生态系统中，土壤是原核生物(如古细菌、细菌和放线菌等)和真核生物(原生动物、真菌、藻类和地衣等)栖息的场所。真核生物包括原生生物界、真菌界、植物界和动物界，这些动物、植物、微生物在土壤中各自发挥着重要的作用。比如，微生物是土壤生态系统的核心，主要扮演着“分解者”的角色，在有机物分解与转化、养分循环与利用、土壤肥力形成和温室气体产生中发挥着重要的作用，更是地球C、N、P和S等物质循环的“调节器”[1]。而真菌影响生态系统的结构和功能，在分解植物菌根共生体和病原体中扮演着重要的角色[2]。

近年来，以随机扩增多态性(RAPD)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)等分子生物学技术为基础的方法在土壤真核生物和微生物研究中得到了广泛的应用，如Gao等[3]利用PCR-RAPD方法对重金属污染的土壤进行了分析，表明RAPD标记可以作为一个有效评价土壤健康的方法。Naether等[4]利用16S rRNA基因指纹识别方法(末端限制片段长度多态性T-RFLP和变性梯度凝胶电泳DGGE)对来自德国3个不同地区草原和森林的土壤中酸杆菌门(Acidobacteria)进行了分析，结果表明，草地和森林中酸杆菌门的多样性差异很大，土壤pH值、有机碳、总氮、C∶N比、磷、硝酸盐、氨、土壤水分、土壤温度和土壤呼吸对酸杆菌门群落组成均有显著影响。但这些方法存在很大的局限性，通常只能检测到环境中优势菌群的存在，只有占整个群落细菌数量约1%或以上的类群能够被检测到[5-6]。Roche 454高通量测序技术的出现为土壤微生物群落多样性的研究带来了新的思路，该技术已在真核生物和土壤微生物研究中有报道。例如Bates等[7]利用454测序平台对主要古细菌在全球范围的分布进行了分析，采样点遍及南、北美洲和南极洲共146个点，发现土壤C∶N比是唯一与古细菌相对丰度相关的因子，即低的C∶N比有高的古细菌丰度，其中泉古菌门(Crenarchaeota)是古细菌中的优势菌。Will等[8]利用454测序技术，对不同土地利用方式下的9个草地土壤细菌V2-V3 16S rRNA基因区进行了分析，发现细菌多样性(H′)与有机碳含量、总氮含量和碳氮比之间呈正相关性，这种相关性随着土层深度的增加而降低。Liu等[9]利用焦磷酸测序技术分析了饮用水生物膜中的真核生物与细菌群落，认为细菌群落占主要地位。

草地是我国陆地生态系统重要的组成部分，由于气候变化和人为因素等的影响，我国草地退化严重，其中土壤退化是其所面临的一个主要问题。封育被认为是实现植被自然恢复的有效手段之一[10-11]。目前，国内外关于长期封育对草地地上植被、土壤养分和微生物的影响已有大量的研究[10-14]，但对土壤微生物的研究仅局限于微生物量等方面，测定方法以传统培养法为主。我国尚未见基于454焦磷酸测序法对草地土壤真核生物多样性的研究。基于此，本研究利用454 Roche高通量测序平台对黄土区典型草地表层土壤中真核生物进行深度测序，对封育草地土壤真核生物多样性进行分析，旨在探讨454测序技术在研究草地土壤生物多样性方面的优势，为该技术的应用提供理论和实践基础。

1 材料与方法

1.1研究区概况 本研究区位于云雾山草原自然保护区，保护区在宁夏回族自治区固原市北部45 km (106°24′-106°28′ E，36°13′-36°19′ N)，海拔1 800～2 150 m，处于黄土高原腹地，植被类型为典型草原。本区为温带半干旱区大陆性气候，年平均气温7.01 ℃；7月气温最高22～25 ℃；1月气温最低-18～-15 ℃；>0 ℃年积温2 847～3 592 ℃·d；年日照时长2 300～2 500 h；年降水量425.5 mm，60%～75%的降水集中分布于夏季7-9月；无霜期137 d。保护区总面积为6 660 hm2，其中包括核心区(1 000 hm2)、缓冲区(1 300 hm2)和试验区(4 360 hm2)，核心区内设置有不同封育时期的群落类型。经2012年全面考察，保护区内共有植物313种，其中栽培植物16种，野生植物297种，主要优势植物有长芒草(Stipabungeana)、大针茅(S.grandis)、百里香(Thymusmongolicus)、铁杆蒿(Artemisiasacrorum)和星毛委陵菜(Potentillaacaulis)等。

1.2研究方法

1.2.1样地选择及土壤样品采集 于2012年8月中旬，在核心区选择不同封育年限(5、9、15、22和30 a)的天然草地群落作为采样地，同时，在保护区外围选择自由放牧样地作为对照。在每个样地上坡、中坡和下坡每隔15 m设置1 m× 1 m的样方3个。植物样方调查结束后，去除地面枯落物，在每个样方四个角和中间位置各打一个土钻(直径4 cm)混匀作为一个土样，采样深度0-20 cm。采集的新鲜土样快速过1.4 mm的筛后，从9个土壤中各取约10 g快速混匀后用液氮冷冻，带回实验室放入-80 ℃冰箱保存，用于微生物群落多样性分析；剩余下的土样分成两部分，一部分放入4 ℃冰箱保存，用于土壤微生物量等测定；另一部分室内风干，用于土壤养分和酶活性等测定。

1.2.2土壤理化性质测定 土壤有机碳测定采用低温外加热重铬酸钾氧化-比色法，全氮、全磷含量利用元素分析仪(VARIO EI III CHON，Elmentar，Germany)。土壤速效钾用NH4OAc提取后，用火焰光度计测定，速效磷用NaHCO3法提取后，用分光光度计测定。

1.2.3土壤总DNA提取 称取0.5 g研磨成粉末并充分混匀的土壤样品，使用OMEGA公司的E.Z.N.A Soil DNA抽提试剂盒提取基因组DNA。具体操作步骤参考试剂盒说明书进行，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA，所得DNA于-20 ℃保存用于后续试验。

1.2.4PCR扩增与454高通量测序 根据相关文献[9,15]选择V4区引物3NDf和V4_euk_R2用于真菌18S rRNA分析，其序列为3NDf-5′-GGCAAGTCTGGTGCCAG-3′、V4_euk_R2-5′-ACGGTATCT(AG) ATC(AG)TCT TCG-3′，该引物序列是带有“5′454 A、B接头-特异引物3′”的融合引物，A为测序端，需加标签，B端引物可以共同。PCR反应体系为20 μL，包括：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，引物(5 μmol·L-1)各0.8 μL，FastPfu Polymerase 0.4 μL，模板DNA 10 ng, 用ddH2O补足20 μL。PCR反应条件 95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25个循环。72 ℃延伸5 min，10 ℃保存。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物。

所得PCR产物经切胶回收后用PicoGreenR dsDNA定量试剂盒进行荧光定量，然后按照每个样品测序量比例混合。样品送到上海美吉生物公司用454高通量测序仪测序。

1.3数据分析与处理 数据分析流程主要包括：1)测序数据统计与优化。首先将测序接头、Barcode和前引物序列去除后进行有效序列统计分析；然后利用Seqcln检测接头和修剪末端，Mothur筛选得到优化序列。2)序列分析。利用软件Mothur经与Silva数据库比对，使用UCHIME检测去除Chimeric序列，最后用Furthest neighbor方法根据序列相似度的方法将序列聚类生成OUT(Operational Taxonomic Units)。3)生态学分析。利用Mothur软件进行多样性指数、稀释曲线、分类学和群落结构组分等分析。

统计分析全部用软件SPSS 19.0完成。

2 结果

2.1土壤理化性质 随着封育时间的延长，土壤pH和容重呈下降趋势；而有机碳、全氮、全磷、速效磷和速效钾均表现出先增加后降低然后再增加趋势(表1)。

表1 不同封育时间土壤理化性质Table 1 Soil Physico-chemical properties at different times

2.2测序序列统计 利用454高通量测序，14个样品共获得97 684条序列，总碱基数为41 083 452 bp，序列平均长度420 bp。有效序列数量及长度分布见表2。经优化丢弃长度小于200 bp、模糊碱基数大于0、序列平均质量低于25的序列后，14个样品获得84 492条序列，总碱基数36 880 126 bp，平均序列长度436 bp。有效序列和优化序列长度分布图见图1a和b。

表2 有效序列数量及长度分布Table 2 The number and Length distribution of valid sequences

2.3多样性指数 多样性指数分析中用于指数评估的OTU相似水平常选择0.03(97%)、0.05(95%)和0.10(90%)。多样性指数主要包括丰富度指数Ace和Chao、多样性指数Shannon和Simpson、测序深度指数Coverage。用Mothur软件计算的6个样品(不同封育时期)微生物群落多样性指数见表3。在0.03和0.05相似度水平下，各基因稀释曲线均未趋向平滑，在0.01水平下，稀释曲线达到明显的平坦阶段(数据未列出)。但从Coverage来看，该指数基本上都超过了90%，说明测序结果反映了所测样品中微生物的真实情况。在0.03相似度水平下,从多样性指数Shannon可以看出，各群落多样性大小顺序为0 a>5 a>22 a>15 a>30 a>9 a。不同封育时间相关性分析表明，土壤pH、容重和速效钾与多样性指数Shannon在0.03、0.05和0.01水平下均无显著相关性，而有机碳、全氮、全磷、速效磷与多样性指数Shannon在0.05水平下均呈显著负相关(P<0.01)。

2.4真菌、动物和植物区系分布 OTU分类学结果表明，土壤中真菌群落主要由子囊菌门(Ascomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、绿藻门(Chlorophyta)、球囊菌门(Glomeromycota)和变形菌门(Proteobacteria)组成。从纲水平来看(图2)，散囊菌纲(Eurotiomycetes)、座囊菌纲(Dothideomycetes)、粪壳菌纲(Sordariomycetes)、盘菌纲(Pezizomycetes)、锤舌菌纲(Leotiomycetes)、元盘菌纲(Orbiliomycetes)、伞菌纲(Agaricomycetes)和变性菌纲(Alphaproteobacteria)是组成真菌群落的主要真菌纲。不同封育时期草地土壤中真菌优势群落在不同分类学水平下差异较大(表4)。

图1 有效序列和优化序列分布图Fig.1 Length distribution of valid sequences and trimmed sequences

表3 不同封育年限草地土壤微生物群落多样性指数Table 3 Diversity index of microbial community of grasslands with different enclosing years

土壤中动物群落区系主要包括脊椎动物门(Craniata)、节足动物门(Arthropoda)、线虫门(Nematoda)和环节动物门(Annelida)。在纲水平上(图2)，主要包括脊椎动物(Craniata)、有孔虫界(Rhizaria)、刺嘴纲(Enoplea)、色矛纲(Chromadorea)、丝足虫类(Cercozoa)、变形虫(Lobosa)、环节动物(Annelida)和六足类(Hexapoda)。不同封育时期草地土壤中不同分类学水平下优势动物区系见表5。

图2 不同封育年限真核生物群落结构分析柱状图Fig.2 Barplot of eukaryon community of grasslands with different enclosing year

表4 不同封育年限不同分类学水平草地土壤中优势真菌群落Table 4 The dominant fungi community of soil for different taxonomic level at different times

土壤中的主要植物信息包括陆生植物(Embryophyta)和单子叶植物纲(百合纲)(Liliopsida)(图2)。从物种比对结果来看，这些植物种主要包括寸苔草(Carexduriuscula)、苔藓植物(Bryophyta)、蛇床子(Cnidiummonnieri)、藓生马先蒿(Pedicularismuscicola)、野甘草属(Scoparia)、人参属植物喜马拉雅人参(Panaxpseudoginsengsubsp.himalaicus)和紫花地丁(Violaphilippica)。

表5 不同封育年限不同分类学水平草地土壤中优势动物群落Table 5 The dominant soil animal communities of grasslands with different enclosing years at different taxonomic level

3 讨论

以分子技术为基础的现代生物学研究方法，如PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-SSCP、荧光原位杂交技术(FISH)、基因芯片(Microarry)、磷脂脂肪酸图谱分析(Phospholipid Fatty Acid，PLFA)和PCR-DGGE/TGGE等极大地推动了土壤生物学研究的深度和广度。其中运用比较广泛并被普遍认可的是PCR-DGGE/TGGE法，而DGGE/TGGE的局限性在于，检测的DNA片段长度范围以200～900 bp为佳，超出此范围的片段难以检测[5]，PCR扩增所需G/C碱基对含量至少达40%，通常只能检测到环境中优势菌群的存在，只有占整个群落细菌数量约1%或以上的类群才能够通过DGGE检测到[6]。454焦磷酸测序技术的最大优点是与上述以DNA为基础的传统方法相比，可以获得大量土壤中的生物学系统分类信息；另外， 454技术具有快速和费用低廉的特点，与传统的Sanger技术相比，费用可以节约20～30倍，同时省去了对环境样品进行克隆的步骤[16]。研究表明，引物3NDf和V4_euk_R2可以检测到环境中大多数的真核生物(真菌、微型藻类、原生动物、后生动物等)[9,15]，因此，本研究选择了这两条引物对真核生物18S rRNA V4区进行分析。对优化序列进行分类学分析时有大量的norank序列，特别是封育30 a草地超过90%的序列属于norank序列，即在与现有数据库中已知序列进行比对时，无法获得该序列的分类学信息，因此，我们推断这些序列可能是一些新发现的土壤微生物类群。如OBrien等[17]在对混交落叶林中土壤与凋落物微生物研究结果分析后发现有12%的序列无法获得具体物种信息。

生物学分类结果表明，不同封育时期草地真核生物组成结构和比例不同(图2、表4)，没有明显的线性关系。随着封育时间的延长，土壤有机碳、全氮、全磷和速效磷与多样性指数Shannon均呈显著负相关。已有研究表明，植物通过影响土壤理化性质等进一步影响土壤微生物多样性[18]。随着封育时间的延长，草地植被物种组成、盖度和地上生物量等显著增加，因而产生的大量枯落物对提高土壤养分和增加土壤微生物多样性发挥着重要作用；而土壤微生物是土壤有机碳、全氮和全磷等转化和循环的主要推动力。因此，我们可以推断，土壤养分和生物多样性随着封育时间的延长并不是一个线性相关的同步过程，应该有一个时间阈值，如果从土壤恢复水平来考虑，在这个阈值点就可以对封育草地进行合理的利用。

真菌主要存在于土壤表层10 cm处，在30 cm以下很难找到。藻类一般生活在土壤表面或者上表层数毫米处，这些藻类有可能会成为其他微生物的营养源被吞噬。大部分原生动物因为需要浓度相对较高的O2，一般只存在于表层15 cm处，这些原生动物是土壤细菌和藻类的捕食者。因此，本研究中主要采集0-20 cm表层土壤进行了分析。结果表明，草地真菌主要由子囊菌门、壶菌门、担子菌门、绿藻门、球囊菌门和变形菌门组成，这与前人[2]对地中海草地真菌群落的研究结果基本一致，但在科、属、种分类水平上具有各自的优势菌。

OTU分类结果表明，优化序列中有超过60%的序列分类结果属于动物区系，其中脊椎动物占到了54%。从不同分类学水平可以发现(表5)，动物区系以脊椎动物中的鼠兔科居多，这一结果可为草原动物区系调查提供新的研究思路。从图2可以看出，脊椎动物和有孔虫界在纲水平上也占了很大比例，从不同分类学水平结果来看，土壤中多细胞后生动物(尖线虫)和单细胞原生动物(鞭毛虫)居多。一般后生动物参与枯枝落叶的破碎和分解过程，使得这些植物残体有利于微生物的进一步分解，其中线虫一般又靠取食微生物和其他动物生存。原生动物在土壤中发挥着参与土壤植物残体分解和调节细菌数量的作用，其中鞭毛虫以取食细菌作为食物源。这些动物、植物和微生物在土壤中各自发挥着重要的作用，构成了土壤中一条完整的生物链。

为避免土壤样品中有植物或者枯落物残留影响测序结果，在土壤取样过程中，将表面枯落物和植物去除并过筛。从分类结果中发现有植物基因组信息，主要是陆生植物和单子叶植物纲，表明土壤中存在大量这些植物的根系分解物，这些植物残体分解物可能是土壤养分和微生物的主要养分库来源。其中，藻类植物中绿藻门(Chlorophyta)的链形植物(Streptophyta)占了很大比例，同时发现了属于真核微生物中藻类壳衣藻科的Cephalomonasgranulata。藻类为单细胞或多细胞的真核原生生物，是土壤生物群落的重要组成部分，为土壤有机质的最先制造者。通过与云雾山植物区系调查结果比较，发现有新的植物种，如蛇床子、藓生马先蒿和人参属植物喜马拉雅人参。这一发现为研究该地区原始植被提供了新的思路，例如有些植物种由于草原退化可能已经消失，通过这一方法可以还原该地区原来植物种的分布情况，这可能会对了解黄土高原原始植被组成提供新的信息。

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