木芙蓉叶提取物抗病毒作用实验研究

张 丽，周长征

(山东中医药大学药学院，山东 济南 250355)

木芙蓉叶为锦葵科植物木芙蓉HibiscusmutabilisL.的干燥叶，其味微辛，性凉，归肺、肝经，具有清肺凉血、散热解毒、消肿排脓等功效，临床主要用于肺热咳嗽、瘰疬等的治疗[1]。本实验通过体外建立细胞感染模型试验和体内感染小鼠试验来验证木芙蓉叶提取物具有抗病毒的药理活性，以期为木芙蓉叶能开发成一种防治病毒的新药提供药效学依据。

1 实验材料

1.1 药物 木芙蓉HibiscusmutabilisL.叶购于安徽濠州药材市场，由周凤琴教授鉴定。阳性对照药利巴韦林针剂(100mg/mL，山东鲁抗医药集团有限公司)。

1.2 病毒 呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(Flu A)和副流感病毒(HPIVs)均引自中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所。

1.3 细胞 HEK-293细胞(人胚胎肾细胞系)购自美国Clontech公司。

1.4 试剂 MEN培养基(美国Gibco公司)；新生小牛血清(杭州四季青公司)；胰酶(美国Gibco公司)；细胞维持液(含2%新生牛血清的MEN)；细胞培养液(含10%新生小牛血清的MEN)；其他试剂均为分析纯。

1.5 仪器 CO2恒温培养箱(美国Forma公司)；-80 ℃冰箱(美国Forma公司)；-20 ℃冰箱(中国青岛得贝公司产品)；酶标仪(芬兰Labsystems公司)；倒置显微镜(日本Olympus公司)；高速离心机(德国Heraeus公司)；旋转蒸发仪(中国上海鑫培仪器设备有限公司)。

1.6 动物 昆明种鼠，雄性，体质量13～14 g，洁净级，引自山东大学动物中心。

2 实验方法

2.1 提取物的制备 木芙蓉叶煎煮3 h，水提液减压浓缩至稠浸膏，加入乙醇进行醇沉,过滤得到沉淀，沉淀用蒸馏水溶解。用D101型大孔吸附树脂进行洗脱得到25%乙醇洗脱液,浓缩洗脱液，使其生药含量为0.5 g/mL，药液过0.2 μm孔径滤膜除菌，备用。

2.2 体外抗病毒试验

2.2.1 药物细胞毒性测定 将HEK-293细胞悬液接种于96孔板中,使其长成单层细胞。用细胞维持液以2倍比稀释阳性对照药品利巴韦林和木芙蓉叶提取物，每孔100 μL，每个稀释度纵向设立3个复孔，平行方向设2行正常细胞对照。将96孔板置37 ℃,5%CO2培养箱中培养，每日用显微镜观察细胞生长状态和形态的变化，连续观察5 d，染色，使用酶标仪在540 nm处测定各孔光吸收值，利用Reed-Mucnch法计算药物半数中毒浓度(TC50)[2]。

2.2.2 药物的抑毒作用 将细胞悬液接种于96孔板中，使其长成单层细胞,倒掉培养液，将待测药液按2倍比稀释顺序横向接种在各孔中,每孔100 μL药液，然后接种100TCID50的不同病毒液50 μL，每种病毒横向接种1行,纵向设置3个复孔，每块96孔板均设置利巴韦林阳性药品对照，病毒对照，正常细胞对照以及空白对照(无细胞生长)。置37 ℃，5%CO2培养箱中培养5 d,每日观察细胞生长状态和形态，以细胞病变效应(CPE)为指标，以病毒对照出现4级CPE为终点，染色，使用酶标仪在540 nm处测定各孔光吸收值，计算细胞存活率，利用Reed-Mucnch法计算半数有效浓度(EC50),得到治疗指数TI=(TC50/EC50)，治疗指数越大表示药物作用越强。细胞病变效应(CPE)划分级别[3]：0级细胞无病变出现，正常生长；1级细胞出现25%以下的病变；2级细胞出现25%～50%的病变；3级细胞出现50%～75%的病变；4级细胞出现75%以上的病变。

2.3 体内抗病毒试验

2.3.1 接种病毒剂量的测定 昆明种小鼠40只，将动物按体质量随机分为4组，每组10只，分别为：病毒大剂量组、病毒中剂量组、病毒小剂量组和正常对照组。各组动物乙醚麻醉[4]下分别鼻腔接种上述RSV毒液(效价320∶1)50、25、12.5 μL和细胞培养液50 μL，常规喂养，每日观察动物存活情况，记录死亡动物及时解剖，做病理学检测。在第7天末次给药40 min后，将动物眼动脉丛放血，牵颈臼处死，无菌取肺组织，做病理学检测[5]。

2.3.2 药物体内抗病毒活性测定 将动物随机分为正常对照组、病毒模型对照组、利巴韦林对照组和木芙蓉叶提取物大、中、小剂量治疗组，每组10只。在乙醚麻醉下，正常组动物鼻腔接种细胞培养液25 μL，其余动物均鼻腔接种RSV毒液25 μL。药物灌胃，每日2次，连续7 d。每日观察动物鼻腔是否有分泌物、存活情况，在第7天末次给药4 h后,将动物称重后眼动脉丛取血、牵颈臼处死，无菌条件下取肺组织，称重计算肺指数，得到肺指数抑制率[5]。(肺指数=小鼠肺重/小鼠体质量×100%；肺指数抑制率=(病毒对照组平均肺指数-给药组平均肺指数)/病毒对照组平均肺指数×100%)

3 实验结果

3.1 体外抗病毒试验结果 木芙蓉叶体外抗病毒试验结果表明木芙蓉叶提取物对3种病毒都有不同程度的抑制作用,其提取物对抑制呼吸道合胞病毒(RSV)的增殖有较为显著的作用，治疗指数达到了89.08，对甲型流感病毒(Flu A)也有较好的抑制作用，但对副流感病毒(HPIVs)致细胞病变的抑制作用相对较小(见表1)。

表1 木芙蓉叶体外抗病毒试验结果

3.2 体内抗病毒试验结果

3.2.1 接种病毒剂量测定的结果 与正常对照组比较，接种病毒组动物毛色暗淡,缺乏光泽。正常对照组动物无死亡；大剂量病毒组动物在造模第6天死亡3只；中、小病毒剂量组动物无死亡。大剂量组肺组织外观出现明显充血、出血斑点或花纹等症状,有2只动物出现一叶肺萎缩，有3只动物出现一叶肺实变；中剂量病毒组动物肺组织也可见到充血或花纹;小剂量病毒组3只动物肺组织出现斑点。病毒重分离大剂量病毒组有9只、中剂量8只、小剂量2只分离到病毒(见表2)。考虑到本实验的目的是观察木芙蓉叶提取物防治上呼吸道感染的效果,所以决定采用25 μL病毒为造模适宜剂量。

表2 接种病毒剂量测定结果

3.2.2 药物体内抗病毒活性测定结果 通过统计学数据处理,病毒对照组与正常组比较肺指数有显著差异(P<0.01)，RSV可以引起正常鼠肺指数的升高，表示造模成功；经过药物灌胃治疗后，3组木芙蓉叶提取物给药组，利巴韦林阳性对照组均能降低由RSV引起的小鼠肺部感染的肺指数，与病毒对照组比较均具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)(见表3)。试验结果说明木芙蓉叶提取物可以抑制由RSV引起的小鼠上呼吸道感染,并且在一定的剂量范围内，其活性随剂量的增大而增强。

4 讨论

上呼吸道感染是临床上的常见病，常由呼吸道合胞病毒、流感病毒和副流感病毒等引起。目前治疗呼吸道病毒感染的药物主要有利巴韦林、金刚烷胺、聚肌胞等药物[6],这些药物的抗病毒谱相对较窄，而且这些药物的不良反应较大，所以寻求效果显著、不良反应小的药物是目前研发的主要目标，所以中药成为治疗病毒性上呼吸道感染的热门。[7-8]

表3 木芙蓉叶提取物对RSV感染小鼠肺部炎症(肺指数)的影响(±s,n=10)

通过体外抗病毒实验证明，木芙蓉叶提取物对RSV等3种病毒均具有体外抗病毒作用，尤其是对RSV的抑制作用较强;通过体内试验从肺组织外观可以观察到肺组织的病变程度有了明显的减轻，肺指数降低较为显著,证明木芙蓉叶提取物在所试剂量范围内对RSV引起的肺部炎症有明显的抑制作用。所以综合体内、体外实验的结果可知木芙蓉叶提取物具有较好的抗病毒作用，为治疗上呼吸道病毒感染疾病提供了充分的药理药效学基础。

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