艾炷灸对兔动脉粥样硬化斑块稳定性物质基质金属蛋白酶-2、9mRNA的影响

章海凤,常小荣*,刘 密,岳增辉,谢 辉,刘未艾

(1.湖南中医药大学针灸推拿学院，湖南 长沙 410007；2.郴州市第一人民医院，湖南 郴州 423000)

基质金属蛋白酶是锌离子依赖的一组蛋白水解酶(matrix metalloproteinases，MMP)，MMP主要功能为降解多糖以外的全部细胞外基质(extracellular matrix，ECM)成分，ECM成分主要有胶原蛋白、非胶原蛋白、蛋白聚糖以及弹力蛋白等,在静态下ECM对动脉粥样硬化斑块起到支持、连接和保护的作用,而炎性细胞浸润及炎性介质的释放能打破ECM的动态平衡。动脉粥样硬化的主要病理特征是血管壁慢性炎症改变，受到致病源侵袭的血管内皮细胞表达黏附分子，吸引大量的炎症细胞进入内皮层，其分别释放的各种细胞因子在斑块形成、进展和破裂中发挥着关键的作用。因此,ECM合成减少和降解增加，是斑块破裂引发缺血事件的主要内在原因，而基质金属蛋白酶对ECM的降解成为动脉粥样斑块不稳定的重要因素[1]。针灸用于改善动脉粥样硬化具有独特的优势并取得了良好的临床疗效[2]，针灸还具有简单易行、经济有效的特点，因此课题组进一步提出：艾炷灸是否可以通过调节基质金属蛋白酶-2、9表达的变化，从而达到稳定粥样斑块的作用。这将为临床合理应用针灸治疗干预本病的发生发展，提供重要的实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康新西兰大耳白兔60只，雌雄各半，体质量1.8～2.2 kg，3月龄，由湖南东创实验动物中心提供(合格证号：医动检证字2006-0001)，普通饲料由湖南东创实验动物中心提供。每只分笼饲养于湖南中医药大学实验动物中心,饲养温度20～25 ℃，相对湿度50%～70%。将60只兔随机分为4组，每组15只，即：空白组(空白对照组)；模型组(AS模型组)；艾炷灸组(AS模型加艾炷灸)；西药组(AS模型加阿托伐他汀)。

1.2 主要试剂 艾炷：选用苏州东方艾绒厂生产的“神灸300灸”艾炷(型号:东方1型，艾炷下有3 mm厚的纸制底盘，可直接黏于穴位上)，阿托伐他汀钙片(北京嘉林药业股份有限公司产品，国药准字号：H19990258，批号：090203440)；牛血清白蛋白、胆固醇(sigma)；卵清白蛋白、血脂试剂(罗氏)；胆酸钠(上海蓝季科技发展有限公司)；2.5%戊二醛,2%锇酸，50%、70%、90%、100%各浓度丙酮,Epon812环氧树脂包埋液(中南大学湘雅医学院超微结构检测中心配制)；原位杂交试剂盒(天津灏洋生物公司)。

1.3 造模方法 除空白组外,其余3组均喂饲高脂饲料(在普通饲料中加15%蛋黄粉、5%猪油、2%胆固醇、0.5%胆酸钠，由湖南中医药大学实验动物中心加工成颗粒饲料),并于第1、3、5天各从耳缘静脉注射牛血清白蛋白125 mg/kg体质量，共3次；同时用卵清白蛋白进行皮下注射，2.5 mg(kg·/次)，2天1次，共5次，空白组只喂普通饲料，每只兔进食量按30 g/(kg·d)给予，并根据体质量增减不断调整进食量。各兔均自由饮水,共饲喂16周，每周称体质量1次并记录。

1.4 实验方法 艾炷灸组每天喂饲高脂饲料同时并进行艾炷直接灸，第Ⅰ组选穴为巨阙及双侧天枢、丰隆共5穴，第Ⅱ组选穴为双侧心俞、肝俞及脾俞共6穴。取穴定位参照《实验针灸学》[3]及拟人比照法制定。取穴定位后剪毛，将直径0.5 cm的艾炷直接黏于穴位上，点燃施灸，待艾炷燃完余热散尽后再换另1壮。每穴连续灸3壮(约15～20 min),每日1次，Ⅰ组、Ⅱ组穴位隔日交替施灸，连续治疗16周；西药组每天喂饲高脂饲料，并在高脂饲料中加入阿托伐他汀1 mg/(kg·d)；空白组每天喂饲普通饲料，不进行任何干预；模型组每天喂饲高脂饲料，不进行任何干预。

1.5 观察指标及检测方法 兔动脉粥样硬化斑块中MMP-2、MMP-9 mRNA的表达检测，兔处死后,快速将主动脉从根部分离至腹主动脉分叉处断离，取主动脉弓下1.5～3.5 cm、长约2 cm的一段组织，纵向剪开摊平，放入4%多聚甲醛液内固定，4 ℃保存。将固定后的组织材料进行洗涤与脱水；进行适当的透明处理；然后浸蜡与包埋；包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形,进行贴片与烤片后待检。采用原位杂交法检测兔动脉粥样硬化斑块中MMP-2、MMP-9 mRNA的表达。取斑块全部为目标位置，每张玻片随机取400倍照片5个视野。用IMAGE-PLUS-5.0软件进行灰度扫描，测定吸光度IA值，取其平均值进行半定量分析(颜色标准H 7-50，S 0-255，I 0-128)。

2 结果

艾炷灸对兔动脉粥样硬化斑块中基质金属蛋白酶-2、9 mRNA表达的影响，见表1。

表1 艾炷灸对兔动脉粥样硬化斑块中MMP-2、9 mRNA表达的影响(±s) IA值

由表1可以看出：与空白组相比，模型组AS斑块中MMP-2、9 mRNA表达差异具有统计学意义(P<0.01)，表明通过高脂饮食和免疫损伤成功建立了兔AS模型。与模型组相比,艾炷灸组和西药组AS斑块中MMP-9 mRNA表达差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)，表明艾炷灸和西药组能抑制兔AS斑块中MMP-9的表达；与模型组相比，西药组AS斑块中MMP-2 mRNA表达差异具有统计学意义(P<0.01)，而艾炷灸组AS斑块中MMP-2 mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)；与西药组相比AS斑块中MMP-2、9 mRNA表达差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)，表明艾炷灸抑制兔AS斑块中MMPs表达的作用不如西药组。

3 讨论

AS的发病率随着人们生活水平的提高不断上升，而由此导致了大量的心脑血管疾病的发生，其中约70%～75%心脑血管疾病与AS易损斑块破裂的形成密切相关，MMPs是酶活性依赖锌离子的蛋白酶超家族，MMPs可由AS斑块内的内皮细胞、巨噬细胞、中性粒细胞及平滑肌细胞等产生[4]，而基质金属蛋白酶中MMP-2,9对斑块的不稳定性关系非常密切[5]。易损斑块由于其薄纤维帽、脂质含量多，容易破裂并形成血栓，而AS血栓形成是导致心血管病症发病和死亡的首要原因[6]。因此稳定斑块破裂成为防治急性心血管事件的重要目标。

MMPs已成为心血管病治疗的一个靶点[7],通过减少MMPs的表达是心脑血疾病治疗的新方向。在临床应用较多的是他汀类药，但他汀类药物可能会引起肝毒性和肌肉炎症，而AS是慢性疾病，需要长期用药，病人依从性较差，不利于病人病情的稳定。目前人工合成的MMPs抑制剂如Marimastat(BB2516)[8]、GM6001[9]，具有抑制MMPs的作用，但药物毒副作用较大，且特异性不强，并不能达到预期的效果。

针刺通过抑制内源性MMP-9合成和分泌,在某种程度上可降低MMP-9相关信号传导途径，减轻MMP-9导致的基质降解，使得相关病理过程如脑水肿、白细胞浸润、血肿扩大等得以缓解，达到拮抗脑损伤的作用[10]。针刺可降低MMP-2表达，减少脑水肿程度，起到保护脑组织的作用[11]。针灸在改善AS上能起到比较好的疗效，本课题组在前期研究[12-14]中发现隔药饼灸对高脂血症合并AS有肯定疗效，具有降脂及抗动脉血管内皮损伤的作用，并且隔药饼灸还具有稳定粥样斑块的作用。因此，本次试验推测艾炷灸能否通过调节MMP-2,9的表达，达到稳定粥样斑块、保护脑组织的作用，以丰富针灸治疗AS的治疗方法。

本次研究所选用的阿托伐他汀是目前临床常用于治疗AS的药物，符合公认、有效、可比的研究。研究结果表明，通过高脂饮食和免疫损伤已成功建立了兔AS模型，模型组MMP-2,9的表达明显增高，说明了由炎性细胞产生的MMPs促进了动脉粥样硬化的形成，这与Hangyuan Guo等[15]的实验结论一致；与模型组相比，艾炷灸能达到抑制兔AS斑块中MMP-9的表达作用，相对阿托伐他汀药物，艾炷灸抑制兔AS斑块中MMPs表达的作用不明显。说明艾炷灸对调节MMP-9的表达有一定的作用，艾炷灸可用于稳定粥样斑块，艾炷灸虽然没有达到阿托伐他汀药物的治疗效果，但相对而言，艾炷灸具有毒副作用小、安全、简便的优势，可用于丰富AS的治疗手段。

本次实验中，艾炷灸对兔AS斑块中MMP-2的表达无明显调节作用。我们推测：针灸对AS的治疗效果是肯定的，那么是否是艾炷灸灸炷大小、灸时没有达到有效治疗阈值，或者通过其他的信号途径对AS起治疗作用。在今后的研究中可以进一步探讨灸炷大小、灸时对MMP表达的影响；艾炷灸通过其他调节机制达到治疗AS的目的。

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