蛋白免疫印迹杂交法研究葛根素对成骨细胞TGF-β1及Smad 2/3蛋白表达的影响

钱康琦，孙玉明*，詹秀琴

(1.南京中医药大学第一临床医学院，江苏 南京 210029;2.南京中医药大学基础医学院,江苏 南京210046)

骨骼系统的发育异常导致许多疾病，如骨质疏松、骨关节炎、风湿性关节炎等。骨质疏松症是以骨量减少，骨组织的显微结构发生改变，并伴随骨质脆性增加和骨折危险性升高的一类全身性骨骼疾病。以往的研究[1-2]证实了葛根素具有改善骨质疏松的作用，促进成骨细胞分化。近年来,随着分子生物学技术发展，Smads蛋白家族中的Smad 2/3信号蛋白受到越来越多的关注，而且此类研究尚不多见，因此，从这条信号转导途径研究骨质疏松症的发病机理是一个新的切入点。本实验拟采用成骨细胞体外培养的方法，探讨葛根素对成骨细胞TGF-β1及其信号转导蛋白Smad 2/3蛋白表达的影响。在分子生物学层面，通过蛋白免疫印迹杂交(Western Bloting)法进一步研究观察TGF-β1/Smad信号通路在葛根素防治骨质疏松症的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级，新生24 h小鼠, 均由浙江省动物实验中心提供。动物合格证：SCXK(浙)2008-0033。

1.1.2 药物 葛根素:购自中国药品生物制品检定所，批号：110752-200912，20 mg/支，纯度为96.0%，性状为白色粉末，干燥密闭保存。

1.1.3 主要试剂 胎牛血清(GIBCO，USA)，DMEM培养基(Hyclone)，含EDTA的0.25%胰蛋白酶(WISENT BIOCENTER)，磷酸盐缓冲液(PBS)及Ⅱ型胶原酶(Gibco)，四唑盐MTT(Amresco)，二甲基亚砜DMSO(Sigma)，内参一抗(rabbit β-Actin)(Immunoway)，内参二抗(IgG-HRP)(Jackson)，全蛋白抽提试剂盒，5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒，10×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，10×电转移缓冲液，WB抗体清除缓冲液，WB封闭液，显色液，定影液。

1.1.4 主要仪器 高速冷冻离心机(Sigma)，CO2培养箱(Sanyo，USA)，超净工作台(苏州净化设备厂产品)，三洋超低温冰箱(Japan)，三用电热恒温箱(江苏淮阴医疗器械厂)，隔热恒温培养箱(上海跃进医疗器械厂)，电热鼓风干燥箱(南京实验仪器厂)，倒置相差显微镜(Nikon)，Western电泳仪(Bio-Rad，USA)，PVDF膜(PALL), X光胶片(上海申贝感光材料厂)，多用脱色摇床(江苏金坛市正基仪器厂)，振荡器(上海沪西分析仪器厂)，微量加样器(Eppendorf)，低温冰箱(Japan)，全自动酶标光度计(Bio-Rad,USA)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与传代 采用酶消化法选取新生小鼠(24 h)颅盖骨分离得到成骨细胞。先将胎鼠20只75%乙醇中浸泡10 min；无菌切下颅盖骨置于D-Hanks液内;清除骨膜、血管等结缔组织,用D-Hanks液洗净颅盖骨5～6次，剪成小骨片(1 mm3)，先后于0.25%胰蛋白酶溶液及0.1%Ⅱ型胶原酶溶液中，在恒温37 ℃振荡消化，并重复1次。将含细胞的消化液在1 000 r/min下离心10 min，吸去上清液，沉淀的细胞团块用培养液洗2次,制成细胞悬液，接种于培养瓶，每瓶接种细胞约2×104/mL，5%CO2，37 ℃培养箱中培养，24 h换液1次，直至80%细胞融合(约2～3 d)，常规消化细胞进行传代培养。

1.2.2 葛根素干预液的制备 将葛根素对照品先于DMSO中充分溶解后,于无菌过滤器过滤除菌,使用前加入无血清的DMEM培养液并进一步稀释成为0.01 μg/mL、0.1 μg/mL、1 μg/mL 3种实验所需浓度的干预液，用不含葛根素的无血清培养液做为对照组，4 ℃冰箱保存，备用。

1.2.3 MTT法检测葛根素对成骨细胞增殖促进率 取第3代成骨细胞用于实验,用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液。细胞计数后,将成骨细胞浓度调整为1×104个/mL浓度接种于一次性96孔培养板中,每孔180 μL，培养24 h后加入不同浓度的葛根素溶液，分别为0.01、0.1、1 μg/mL及空白对照组，每组设6个复孔，每孔加药20 μL，空白对照组不加葛根素，加入相同体积的无血清DMEM培养基。加药分别培养24、48、72 h后，避光条件下，每孔加入20 μL MTT(浓度5 mg/mL)，孵育4～6 h后，小心吸弃孔内上清培养液,每孔加入150 μL DMSO，振荡10min使结晶物充分溶解。在酶标仪(波长490 nm)上测定各孔吸光度值(OD)，以空白对照组为基准计算成骨细胞不同时间的相对增殖率，实验重复3次。

1.2.4 Western Bloting法检测相关蛋白表达 各组成骨细胞用葛根素干预液及空白对照组，处理24 h后，提取各组细胞总蛋白，并用BCA法进行蛋白定量。-20 ℃保存。取各组成骨细胞样本70 μg，进行SDS-PAGE聚丙烯胺凝胶电泳，将分离后的蛋白质电转移到PVDF膜上，4 ℃封闭，过夜后按约0.1 mL/cm2的量加入封闭液和适量一抗抗体TGF-β1、Smad2、Smad3(1∶500)摇床摇荡孵育(4 ℃，过夜)。TBST漂洗滤膜4次,每次10 min。将膜与HRP结合的二抗(二抗用封闭液稀释1∶5 000)室温下摇荡孵育2 h，然后用TBST充分洗膜，漂洗4次，每次10 min。将显影液加于PVDF膜上,室温放置1 min。用保鲜膜将膜包好(尽量避免气泡)。暗室中迅速将膜蛋白贴在X光胶片上曝光,洗片机中显影、洗像。调整曝光时间，直至出现最佳条带。

2 实验结果

2.1 MTT检测结果 见表1。

2.2 Western Bloting结果 见图1、图2、图3。

表1 葛根素对成骨细胞增殖的促进(±s)

图1 各实验组TGF-β1蛋白表达含量的变化

图2 各实验组Smad2蛋白表达含量的变化

图3 各实验组Smad3蛋白表达含量的变化

3 讨论

成骨细胞在分化、增殖过程中受到各种分子机制的信号通路的调节[3]。本实验研究则是基于TGF-β1这一信号传导通路的活化作用，其中涉及其相关蛋白Smad2和Smad3的表达。本实验通过体外培养成骨细胞,并且取其第3代采用噻唑蓝还原法(MTT)测定葛根素对成骨细胞生长促进率。数据表明，不同浓度及不同时间作用下，葛根素对于成骨细胞增殖均有促进作用，其中，在24 h各干预组的活化作用最为明显，并且各组对于成骨细胞促增殖呈现出浓度依赖性。

在促成骨细胞分化中存在着TGF-β1/Smads信号转导通路，在复杂的骨代谢调控网络中，已有研究[4-5]证实该信号通路在骨重建中发挥重要作用。活性的TGF-β1既具有刺激骨形成，又具有抑制骨吸收的双重作用,是骨代谢重要的偶联调节因子[6]。体内研究[7]表明：在成骨细胞的细胞膜上有TGF-β1的特异性受体，作用于成骨细胞，调节其增殖和分化，同时它们之间相互作用，从而调节骨形成。在TGF-β1促成骨细胞分化过程中，其下游信号转导分子Smad2、Smad3呈现出由细胞质向细胞核的转位，介导TGF-β1信号。有实验[8]表明Smad3基因剔除引起成骨细胞数目减少，破骨细胞数目增多,导致小鼠骨小梁稀疏、骨密度降低,发生骨质疏松。Smad 2/3是TGF-β1信号转导通路中特异的、起瓶颈作用的重要因子，在骨的形成、重塑和维持过程中发挥着重要作用[9]。通过Smad 2/3的呈递作用给TGF-β1受体复合物，稳定了先前形成DNA-蛋白复合体及其功能，然后通过与含重要转录激活因子或阻碍因子的高分子复合物结合来调节转录[10]。当TGF-β1/Smad信号级链活化后，Smad2、Smad3可能通过不同的Smads信号复合物的形成来选择性调节TGF-β1 依赖的特异基因的表达[11]。

蛋白免疫印迹杂交(Western Bloting)技术是利用抗原及抗体之间的特异性相互识别和结合，实现目的蛋白的检测和初步定量。Western Bloting实验结果表明，TGF-β1及Smad2/3的蛋白表达情况相对于内参β-action有明显差异，各实验组总灰度值比值相比于空白DMEM组随着干预液的浓度不断升高呈现出上升趋势(P<0.05)。Smad 2/3的表达几乎与TGF-β1的表达平行，呈现出浓度依赖性。各给药组在蛋白表达方面，不同程度上调TGF-β1与Smad 2/3阳性表达水平，有一定的量效关系，高、中剂量组明显优于低剂量组。

另外,本研究从TGF-β1/Smad信号通路提示了葛根素对骨质疏松症的治疗作用。葛根素对骨量保持具有正向意义，能够增强成骨细胞分化的敏感性；葛根素亦可通过调控此信号通路影响成骨细胞的增殖和分化，达到防治骨质疏松的目的。在分子生物学层面，葛根素调节和影响细胞内源性基因TGF-β1/Smad信号表达揭示了成骨细胞增殖分化的相关分子机制,又为其促进骨质疏松的治疗提供了新的依据。

[1]田泉,汤旭磊,白孟海,等.葛根素对去卵巢大鼠骨质疏松和血脂的作用[J].中华老年医学杂志,2006,25(7):543-545.

[2]殷晓雪,陈仲强,党耕町.葛根素和淫羊藿甙对成骨细胞生物学作用的比较研究[J].中国骨与关节损伤杂志,2007,22(3):210-212.

[3]石义刚,陶天遵,徐强,等.TGF-β对成骨细胞增殖、分化及OPG基因mRNA表达的影响[J].中国骨肿瘤骨病,2003,2(3):170-172,192.

[4]Lovibond A C,Haque S J,Chambers T J,et al.TGF-beta-induced SOCS3 expression augments TNF-alpha-induced osteoclast formation[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2003,309(4):762-767.

[5]XIN L-ya,HUANG Cui-fen.Mechanism of cutaneous wound contraction accelerated in Smad3 deficient mouse[J].Chin J Clin Reh,2004,8(26):5538-5540.

[6]吴巍,姚欣欣,朱辛奕.TGF-β在骨组织中作用的研究进展[J].吉林医药学院学报,2009,30(1):45-47.

[7]任艳玲,郑洪新,杜松,等.TGF-β1及其信号转导蛋白Smad2/3在去卵巢大鼠骨组织中的表达及意义[J].中国骨质疏松杂志,2005,11(3):300-301.

[8]李文龙,谭晓红,张继帅,等.Smad3基因剔除导致小鼠发生骨质疏松[J].中国比较医学杂志,2006,16(9):561.

[9]王运涛,郑启新,吴小涛,等.Smad 3选择性调节TGF-β1促进大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的实验研究[J].华中科技大学学报,2007,36(5):625-629.

[10]杨隽,司书毅,张月琴.Smad在TGF-B超家族信号通路中的调控作用[J].中国生物工程杂志,2003,23(12):10.

[11]Kretschmer A,Moepert K,Dames S,et al.Differential regulation of TGF-beta signaling through Smad2,Smad3 and Smad4[J].Oncogene,2003,22(43):6748-6763.