骨痛膏对家兔骨愈合过程中骨形态发生蛋白表达的影响

杨济洲，徐 林

(北京中医药大学东直门医院 骨科，北京 100700)

骨折愈合是骨科领域中研究较多的课题，中医药在治疗骨折、促进骨愈合方面积累了丰富的经验，有其特有的优势。骨痛膏源自吉林省民间验方，在临床应用多年，疗效确切，本实验以家兔骨缺损模型为观察对象，以骨折愈合过程中BMP-2mRNA为研究对象。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药物 骨痛膏(由藏红花、血竭、自然铜、三七、木香、米醋组成，长春呈实健康实业有限公司生产制备)，批准文号：吉卫健用字(2008)第12号。

1.1.2 动物 选用健康、雄性、3月龄日本大耳白兔30只，体质量：(2±0.5) kg，由中国中医科学院基础所动物中心提供。

1.1.3 试剂与仪器 戊巴比妥钠，北京市化学试剂公司提供；DAB显色试剂盒、AR1022，武汉博士德生物工程有限公司；BMP-2原位杂交检测试剂盒，天津市灏洋生物制品科技有限公司；光学显微镜：OLYMPUS BX51连接OLYMPUS DP70采集器(DP Controller采集软件)。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 将30只成年雄性日本大耳白兔随机分成2组，分别为国新牌骨痛膏外用药组和空白对照组，每组15只。再将每组15只随机分成3个亚组，即第1周取标本组(A组)、第2周取标本组(B组)、第4周取标本组(C组)，每次参加检测的动物：10只(20个桡骨标本)。

1.2.2 动物模型制作方法 30只日本大耳白兔均以手术造成双桡骨中段宽约3 mm、深达髓腔的缺损骨折模型。取兔称重，以3%戊巴比妥钠，按30 mg/kg体质量腹腔注射麻醉，麻醉满意后，将兔仰卧于台上，前肢剪毛，碘伏消毒，铺无菌孔巾，前肢中段桡骨背侧行2 cm纵行切口，依次切开皮肤、皮下组织，暴露桡骨中段，于旋前圆肌止点下切开骨膜，剥离1 cm左右，用咬骨钳造成宽约3 mm、深达髓腔的骨质缺损，注意勿损伤神经、血管，生理盐水冲洗，逐层缝合皮下组织及皮肤。用药组外敷骨痛膏，所有模型兔均以石膏夹板外固定。术后连续3 d肌注青霉素以预防感染，40万u/次，2次/d。

1.2.3 给药方法 造模成功后即开始对实验组外用骨痛膏，将药涂抹于透气棉布上,环绕桡骨(手术切口0.5 cm以内不用)外敷骨折处,外用石膏夹板固定，每2 d换1次药。空白对照组予石膏夹板外固定。

1.2.4 标本取材 兔耳缘静脉注入空气约2 mL，将实验兔空气栓塞致死，造模后第7天处死A组，第14天处死B组，第28天处死C组。自肘关节离断，取双侧前肢送检。

1.2.5 观察指标 1)原位杂交染色观察及分析：取包括骨折断端及其周围软骨痂约1 cm。标本置入质量分数为4的多聚甲醛中固定48 h后，再经质量分数为125 g/L EDTA-Na24 ℃下彻底脱钙，每4 d更换脱钙液1次。待针可刺入骨皮质时停止脱钙,随后用石蜡包埋，制备6 μm厚度切片,切片经脱蜡水化后，经山羊血清封闭内源酶，按原位杂交操作规范及试剂盒说明进行试验。原位杂交设空白对照,平行操作，标记探针均用PBS缓冲液替代。阳性细胞浆和(或)膜着色呈棕黄色。以每个切片6个视野的阳性细胞数之平均数代表该切片的阳性细胞数，6个视野的总MOD之平均数为该切片阳性细胞MOD值。用LEICA DM6000B病理图像分析仪Leica Qwin Pro图分析软件对BMP-2mRNA染色面积测定，A、B、C各组进行t检验。

2 结果

2.1 一般情况 各组实验兔麻醉清醒后即能用前肢着地，处于正常的蹲伏状态,术后第1天即能在笼中自如活动，并能正常取食及饮水。各组实验兔伤口无红肿、渗液，呈一期愈合。肉眼观察术肢局部组织情况，外用药组血肿机化、表面骨痂出现较早且明显。

2.2 原位杂交染色观察及分析 术后第1周，用药组即出现纤维性骨痂并出现BMP-2mRNA扩增表达，在外骨痂一些成熟软骨细胞中亦可见BMP-2mRNA扩增表达,对照组未见骨痂，在成纤维细胞中未见明显阳性染色细胞。术后第2周,用药组可见大量BMP-2mRNA阳性染色细胞，阳性表达集中在成骨细胞、骨细胞、软骨基质、间质细胞等，对照组软骨细胞、成骨细胞及周围基质均呈弱阳性表达，且着色明显浅于用药组。术后第4周阳性细胞数量及范围明显下降，骨小梁排列紧密，编织骨已向板层骨转化，阳性染色程度明显减弱，在软骨细胞中仍有少量表达，成熟的骨细胞未见明显阳性染色，但着色较浅，骨小梁排列稀疏，可见着色的软骨细胞、成骨细胞等。在全部切片中骨痂局部BMP-2mRNA浓度最高，正常骨组织未见阳性染色。纵向比较，2组术后染色均呈先强后弱，术后染色高峰出现在术后2周。横向比较，用药组阳性染色均较对照组强，尤其在第1、2周。这与免疫组化染色结果完全吻合。阳性颗粒平均光密度值和阳性产物平均积分光密度比较，见表1。

表1 不同观察时间骨痂中BMP-2 表达光密度均值(±s)

3 讨论

中医外治法治疗骨折有着悠久的历史，早在汉代的《居延汉简》中就记载了汉代军医以膏药为主治疗各种创伤的方药和方法。清代名医吴机师提出“凡病多从外入，故医有外治法，经文外取内取并列，未尝教人专用内治也。”和“外治之理即内治之理，外治之药亦即内治之药，所异者法尔”的观点为后世骨伤医家所推崇。中医学认为，骨折愈合的过程就是“瘀祛、新生、骨合”的过程。骨痛膏是由藏红花、血竭、自然铜、三七、木香、米醋调制而成。方中藏红花、血竭、三七活血化瘀、消肿止痛。木香行气止痛。自然铜散瘀止痛、接骨续筋，《本草经疏》中记载“自然铜乃入血行血，续筋接骨之要药也”。米醋性寒味酸，具有软坚散结作用，作为载体和渗透剂与他药合用可增加活血止痛作用[1]。诸药合用共奏行气活血、接骨续筋之功。故从理论上讲在骨折的治疗中，骨痛膏完全符合中医骨折外治的治则。大体观察药组骨痂出现时间明显早于对照组、骨痂量明显多于对照组，可以早期提供骨缺损区的稳定，临床可以早期开始行功能锻炼，减少一些并发症的出现。4周时用药组骨愈合情况亦明显优与对照组,说明外用骨痛膏可以明显促进骨愈合。本实验BMP-2mRNA的转录水平呈动态变化,即骨折后开始升高,2周左右达到高峰,以后逐渐下降,这与王鹏程等[2]的研究近似。施莱[3]研究认为，中药对骨形成的影响可能通过介导BMP而发挥作用。本实验结果显示，骨痛膏可明显促进BMP-2mRNA的表达,促进骨折的愈合，说明外用中药可以明显促进骨愈合。目前，外用中药在骨愈合方面的研究鲜见，但在民间应用广泛，对于骨痛膏中的透皮机理及具体有效成分以及促进骨愈合的具体机制等方面还有待研究。

[1]王静,毛春芹,陆兔林,等.中药醋制法研究进展[J].中国中医药信息杂志,2009,16(1):99-101.

[2]王鹏程,张英泽,刘勇谦,等.内源性骨形态发生蛋白在骨修复中的作用[J].中国矫形外科杂志,1999,6(5):348.

[3]施莱.中药加速骨折愈合机理的研究[J].长春中医药大学学报,2010,26(4):601.