循环肝癌细胞的研究进展和技术问题

张妤 杨霞 殷正丰

•综 述•

循环肝癌细胞的研究进展和技术问题

张妤 杨霞 殷正丰★

复发转移是导致绝大多数肝癌患者术后死亡的主要原因。现有的研究提示，从原发灶或转移灶释放进入血液的循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是肝癌根治性术后复发转移的一个主要根源。在过去的10多年中，尽管CTCs检测技术及其临床意义的研究取得了长足进步，但由于缺乏可使用的肝癌CTCs检测方法，目前人们对于肝癌CTCs临床重要性的认识远不及其他主要类型的肿瘤。可喜的是，近年来关于肝癌CTCs检测方法及其临床意义的研究报道逐渐增多，并且得到一些有趣的结果。本文着重总结已报道的肝癌CTCs检测方法，综述肝癌CTCs作为肝癌复发转移来源的现有实验证据以及其作为肝癌预后标志物的现有研究结果，并讨论肝癌CTCs临床转化应用需要解决的技术问题。

肝细胞癌；循环肿瘤细胞；复发与转移；预后

循环肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）是从原发灶或转移灶释放进入血液循环系统中的肿瘤细胞。已知转移是大多数肿瘤患者死亡的直接原因，而CTCs则可能是形成转移的种子，标志着肿瘤细胞的播散[1]。作为原发灶和转移灶之间的链接，肿瘤生物学和转移的窗口，以及可以多次、实时、非侵入性获取、以及具有肿瘤代表性的“液体活检”（liquid biopsy）样本，CTCs不仅将成为指导个体化肿瘤诊疗的一个不可替代的生物标志物，而且是研究肿瘤转移复发过程和机制的一个重要切入点[2～4]。近年来，随着多种分离、鉴定稀少CTCs实验技术的建立，使大范围的CTCs基础和临床研究成为可能，并已成为肿瘤研究临床转化最活跃的领域之一，目前国际上至少已经有400多个涉及CTCs的临床研究正在进行[2～4]。然而，我国在CTCs研究领域起步较晚，加之投入不足，现已远远落后于欧美国家。其中无论在国内外，由于重视不够，以及缺乏可使用的肝癌CTCs检测方法，肝癌CTCs研究的落后地位尤为突出，人们对于肝癌CTCs临床重要性的认识远不及其他主要类型的肿瘤。好在近年来关于肝癌CTCs检测方法及其临床意义的研究报道逐渐增多，落后局面有望改观。关于CTCs检测方法和临床应用的研究进展可参见我们在其他刊物上发表的文章[4～6]。本文着重综述已报道的肝癌CTCs检测方法，肝癌CTCs作为肝癌复发转移来源的现有实验证据以及肝癌CTCs作为肝癌预后标志物的现有研究结果，并讨论肝癌CTCs临床转化应用需要解决的技术问题。

1 已报道的肝癌CTCs检测方法

在现有的CTCs检测方法中，仅有RT-PCR、微过滤器法、流式细胞术和磁性细胞分选法等方法被报道应用于肝癌CTCs检测，并且都是在梯度密度离心富集单个核细胞后进行检测。

1.1 RT-PCR和qRT-PCR

通过基因扩增方法分析外周血单个核细胞中肝细胞特异性基因或肿瘤细胞相关基因的表达，间接反映肝源性细胞的存在，包括肝癌细胞CTCs。在过去20年中，有研究将甲胎蛋白（AFP）[7]、白蛋白[7]、端粒酶逆转录酶（TERT）[8]和转录因子Snail等[9]基因作为标志物应用于外周血肝癌细胞CTCs的检测。其中只有AFP是一个公认的肝癌标志物[10]。此类方法灵敏度非常高，缺点是CTCs被破坏而无法计数，同时也不能对单个肿瘤细胞进行后续分析。另一个局限则是缺乏合适的肝癌细胞特异性标志物，包括经典的肝癌标志物甲胎蛋白（alpha-fetoprotein，AFP）。

1.2 微过滤器法（microfilters）

特定孔径的过滤膜可使较小的细胞通过，而较大的肿瘤细胞被阻滞在膜上。早期发明的微过滤器结构简单，取名为ISET（isolation by size of epithelial tumor cells）[11]，最先用于循环肝癌细胞的检测。微过滤器的优点是可以滞留若干细胞聚集形成的循环肿瘤微栓（circulating tumor microemboli，CTM），缺点是容易丢失体积较小的肿瘤细胞[12]。而这类肿瘤细胞被证明可能更具侵袭性。

1.3 流式细胞术

由于可以通过针对细胞内或细胞外的多个分子标志物抗体标记肿瘤细胞同时分析多个参数，在理论上流式细胞术分选肿瘤细胞具有高度特异性。但是目前常用的流式细胞术敏感性不高，分析样品量有限，难以分选稀少的CTCs。鉴于CD90和细胞间粘附分子-1（intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1；CD54）被认为是潜在的肿瘤干细胞标志物，近来有研究报道以流式细胞术分析肝癌外周血中表达CD90和ICAM-1的细胞，并把这些细胞定义为循环肝癌干细胞[13～14]。

1.4 磁性细胞分选法

这是目前最为常用的CTCs分选方法，通常采用基于上皮细胞粘附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）抗体的策略分选CTCs，富集效率可达1×104～2×105倍，其中包括专业产品CellSearch Systern已被FDA 批准用于转移性乳腺癌、前列腺癌和结直肠癌CTCs检测。然而遗憾的是，这一策略并不适用于分选肝癌CTCs，因为肝脏EpCAM表达谱不同于其他上皮源性器官，尽管肝脏也是一个上皮源性器官，成年人肝细胞不表达EpCAM，而临床肝癌样本仅有0～20%表达EpCAM[15～18]。根据肝细胞膜表面存在大量特异性去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）的特性[19～20]，以及正常肝细胞不会出现在外周血的事实，我们创建了一种独特的基于ASGPR及其配体相互作用的肝癌CTCs磁性分离方法，结合基于肝细胞特异性标志物Hep Par 1或上皮性肿瘤细胞标志物广谱角蛋白的免疫荧光染色鉴定方法，形成了一种具有高度特异性的肝癌CTCs分离/检测系统[21～22]。相关论文在国际抗癌联盟等单位主办的“Excellence in Oncology（希腊雅典，2010年11月18～20日）”会议上获得一致好评，被大会评为最佳二等奖。检测结果表明，健康者、良性肝病以及其他类型晚期肿瘤病例均未检出CTCs，而80%以上HCC病例可检测到CTCs。

2 肝癌CTCs作为肝癌复发转移来源的现有实验证据

目前肝癌的首选治疗方法是手术切除。但术后复发转移依然是一大难题。据文献报道，高达40%接受肝切除术的肝癌患者第一年会发生复发，而大多数患者会因复发而死亡[23～24]。关于肝癌术后复发转移的原因，最初人们怀疑是因为没有切除干净引起的，于是采用了扩大肿瘤切除范围的根治性手术方法，结果仍然发生复发转移。或许可以用肝内肿瘤细胞通过门静脉分支扩散或者肿瘤再生来解释这种现象，但是一个典型的例子便是肝癌肝移植术，换了一个新的健康肝脏，短期内就在移植肝上新生了肝癌。这是CTCs归巢作为肝癌复发转移来源的一个最好例证[4,24]。

我们的检测结果表明，健康者、良性肝病以及其他类型晚期肿瘤病例均未检出CTCs，而80%以上HCC病例可检测到CTCs。CTCs阳性率和CTCs数目与肿瘤大小、门静脉癌栓、TNM分期、Milan标准符合情况等具有显著相关性。分离的CTCs被检测到HER-2基因扩增和TP53基因缺失[21]。此外，Vona等[11]采用ISET方法检测了44例肝癌血样，在23例（52%）中检出肝癌CTCs甚至微癌栓。近10多年来，肿瘤干细胞在肿瘤发生发展、复发转移以及治疗耐受等方面的关键作用受到特别关注。已有一些研究提示肝癌干细胞的存在，并且鉴定出CD133、CD90、CD44、CD13、EpCAM、OV6等作为肝癌干细胞标志物[25～29]。尽管迄今还没有一个肝癌干细胞标志物得到公认，近年来肝癌CTCs研究的一个显著特点则是以CD90、EpCAM和ICAM-1等为肝癌干细胞标志物检测循环肝癌干细胞。Fan等[13]采用流式细胞术检测了82例肝癌术前血样，发现56例（68.3%）可检出CD45-CD90+CD44+细胞（被作者定义为循环肝癌干细胞）。最近Liu等[14]鉴于ICAM-1可能是一个肝癌干细胞标志物，也采用流式细胞术检测了肝癌血样，发现部分病例可检出CD45-ICAM-1+细胞（被作者定义为循环肝癌干细胞），这样的细胞具有较强的体外成球和体内致瘤能力。如前所述，所有基于EpCAM的分选策略都不适用于检测肝癌CTCs。有趣的是，EpCAM最近被认为是一个潜在的肝癌干细胞标志物。Yamashita等[30]研究结果显示，EpCAM阳性肝癌细胞表达肝癌干细胞标志物，在体外具有克隆和球形成能力，在体内更具致瘤性和侵袭性。在NOD-SCID鼠移植瘤模型中，只有EpCAM阳性细胞能够产生侵袭性肿瘤。这些结果表明EpCAM阳性的细胞具有干细胞样的特性，提示肝癌CTCs中含有小部分EpCAM阳性细胞可能具有自我更新能力。为此，Sun等[31]采用CellSearch System检测了123例肝癌血样EpCAM阳性CTCs，其中66.67%患者术前阳性，41.5%患者术前7.5 mL血可检出≥2个EpCAM阳性CTCs。Schulze等[32]也报道了一个类似研究，发现30.5%（18/59）肝癌和5.3%（1/19）无HCC肝硬化血样可检出≥1个EpCAM阳性CTCs，其中16.5%（9/59）肝癌血样可检出＞1个EpCAM阳性CTCs。上述研究证据和结果提示CTCs可能是肝癌根治性术后复发转移的一个主要根源。

3 肝癌CTCs作为肝癌预后标志物的现有研究结果

目前少数几个关于肝癌CTCs的临床研究只是限于小样本初步评价肝癌CTCs作为肝癌预后标志物的临床意义，包括以CD90、EpCAM和ICAM-1等为肝癌干细胞标志物检测循环肝癌干细胞。Fan等[13]在肝癌切除术前一天对82例肝癌患者采血10 mL，采用流式细胞术检测外周血CD45-CD90+CD44+循环肝癌干细胞，然后随访，平均随访时间为13.2个月，发现发生复发的患者循环肝癌干细胞平均水平高于未发生复发的患者（0.02% vs. 0.01%；P＜0.0001）。如果＞0.01%，术后肝内肝外复发的危险系数均增加。＞0.01%患者的2年无复发生存率和总体生存率均低于≤0.01%患者。因此认为CD45-CD90+CD44+循环肝癌干细胞＞0.01%可以准确地预测肝癌术后复发。Sun等[31]于术前2天及术后1个月对123名肝癌患者采血7.5 mL，采用CellSearch System检测外周血EpCAM+CTCs，平均随访时间为15.1个月，结果在82例（66.67%）患者血液中检测到1～34个EpCAM+CTCs，其中51例患者术前CTCs≥2，而后者术后发生复发早于CTCs＜2的患者。术前EpCAM+CTCs≥2则是一个独立的预测复发的预后因子（P＜0.001)）。另外，术后1个月CTCs检出率显著下降。CTCs一直＜2的患者复发率低于CTCs一直≥2的患者。Schulze等[32]也采用CellSearch System检测59例肝癌患者和19例对照患者外周血EpCAM+CTCs，将CTCs检测结果与总体生存率、BCLC 分期、大血管与微血管侵犯以及AFP水平进行相关性分析，结果显示，CTCs阳性肝癌患者（18例）总体生存时间为460天，显著低于CTCs阴性肝癌患者（746天）。不同BCLC分期的患者CTC检出率不同，从A期～C期检出率依次升高，具有统计学差异。55.6%（10/18）发生大血管侵犯以及62.5%（10/16）发生微血管侵犯的患者均可检出CTCs。而且，CTC检测结果与AFP水平相关，CTCs阳性患者AFP含量似乎更高。因此作者认为，EpCAM+CTCs通常存在于中晚期肝癌患者外周血中，并且与患者预后密切相关。Liu等[14]检测了60例肝癌血样中CD45-ICAM-1+细胞含量，其中30例（50%）循环CD45-ICAM-1+细胞＞0.157%，后者无瘤生存时间和总体生存时间明显缩短。分析结果还表明，肝癌患者血液中高含量CD45-ICAM-1+细胞对于不良预后、门静脉癌栓和腹水是一个独立的危险因子。

4 肝癌CTCs临床转化应用需要解决的技术问题

4.1 关于肝癌CTCs分离检测的技术问题

如前所述，现行的分离方法各有利弊，尤其是分离发生EMT或干细胞样CTCs受到质疑和挑战。因此，实现肝癌CTCs的临床转化需要改进现有技术或创新复合性方法，以建立一个高通量、可靠及经济的检测平台。然而，我们仍然面临重大的技术挑战。一个特别重要的方面是进一步发展新的CTCs捕获方法。理想情况下，一个用于捕获CTCs的特异性标志物应当表达于每个肿瘤细胞的细胞膜表面。事实上，目前并没有这样一个可用的生物标记物，以致于现有的基于生物标记物捕获CTCs的效率和纯度都不够。因此，迫切需要寻找新的生物学或物理学标志物，以便能够更特异、更有选择地捕获和检测所有亚型的肝癌CTCs。

关于CTCs的定义也存在很多疑惑。肝癌常常是多灶性和异质性疾病，同一个肝癌肿块可以包含遗传学上截然不同的细胞群，表型和功能特征可能明显不同。现已明确，CTCs也具有高度异质性以及可能发生凋亡，甚至同一个患者的CTCs存在显著异质性[33]。这使得准确定义CTCs变得困难。由于每个参数可能存在于正常对照或同时为白细胞所具有，目前还没有这样一个单个参数，比如大小、细胞学形态、生物标记物的病理染色，足以定义“真正的”CTCs。此外，由于缺乏一个可检测特点，如EpCAM、CKs和AFP，或由于在操作过程中细胞破坏或丢失，有些CTCs亚型可能不能被现有检测技术检测出来。也许重要的是，特异性和灵敏度可能并不仅限于技术方面，生物学方面也应该引起重视。总之，目前的现状是，并不是所有被检测到的细胞都是恶性细胞，也并不是所有恶性细胞都能被检测到。因此，不同的CTCs定义可能产生不同的CTCs计数，从而具有不同的临床意义。显然，一个“标准”的或“唯一”的CTCs定义在临床上是很重要的。

4.2 关于肝癌CTCs分子鉴定的技术问题

如前所述，CTCs是一个高度异质性群体，不同的CTCs亚型可能存在不同特点。CTCs计数只是证实其是一个肿瘤细胞，而基于分子鉴定检测少数更具存活力、侵袭性和转移能力的CTCs比单独CTCs计数可能更有价值。已知CTCs在历经侵袭、转移各个阶段的过程中，需要获得上皮间质转化、干细胞特性、逃逸免疫监视、抵抗失巢凋亡、耐受治疗等生物学特性，才能闯过层层难关生存下来并增殖，最终形成远处转移灶。而上述每个生物学特性的分子机制都可被用来进行肿瘤分子分型，并且可能成为个体化肿瘤诊疗的靶点。然而，CTCs分子表型鉴定及其临床意义的研究尚处于起步阶段。CTCs分子鉴定不仅需要高敏感和高特异的CTCs分离方法，而且需要针对单细胞或稀少细胞的分子分析技术。而现有的常用CTCs分子鉴定方法也存在一定的局限，比如，针对蛋白标志物的免疫学检测方法敏感性或特异性不够；针对核酸标志物的PCR等检测技术需要破坏CTCs结构，无法观察细胞形态学以及计数靶细胞，更不能对靶细胞进行后续的细胞培养与药敏实验等。而解决CTCs高度异质性问题的技术策略则是对单个CTCs进行分子鉴定和比较分析。目前已有一些这样的尝试[34～35]。相信这会成为未来的一个研究趋势。

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Research progress and upcoming challenges of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma

ZHANG Yu, YANG Xia, YIN Zhengfeng★
(Molecular Oncology Laboratory, Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200438, China)

Recurrence or metastasis is the major cause of mortality in the patients with hepatocellular carcinoma (HCC) who underwent hepatectomy. Circulating tumor cells (CTCs) disseminated from the primary tumor into the peripheral blood are increasingly recognized as the main source of recurrence and metastasis. In the past decade, with the tremendous progress in the technology of CTC detection, there is convincing evidence that CTCs have great potential as a marker for metastatic disease and poor prognosis in patients with a malignancy. However, probably due to the inability of current commercial methods to capture HCC cells, few studies examining CTC counts have been conducted on HCC patients so far, and knowledge about clinical relevance of CTC detection in HCC is lagging behind other major tumor diseases. Fortunately, some interesting and encouraging results have been recently achieved in the HCC CTC detection, and the situation has started to change for HCC. Here we will outline the different approaches available for HCC CTCs, review clinical studies on CTC detection in HCC patients, and formulate upcoming challenges and technical aspects in this field.

Hepatocellular carcinoma; Circulating tumor cells; Recurrence and metastasis; Prognosis

国家传染病重大专项基金（2012ZX10002012-010）；国家自然科学基金（81172207，81272669）

第二军医大学东方肝胆外科医院分子肿瘤研究室，上海 200438

★通讯作者：殷正丰，E-mail:yinzfk@aliyun.com