乳腺干细胞的识别、再生、分化及其调控

张众李连宏 谢丰培

•综 述•

乳腺干细胞的识别、再生、分化及其调控

张众★李连宏 谢丰培

乳腺发育与再生取决于乳腺干细胞的再生。乳腺干细胞及其龛于乳腺导管发育时期分布在乳腺原基导管终端芽（TEB）帽区，在成体乳腺，以规则性的间距分布在整个乳腺导管系统，而主要位于终末导管（TD）。可利用表型标记、Sp分析及体外培养乳腺球形成以识别乳腺干细胞。乳腺干细胞后代的级别分化首先是双能祖细胞，而后，腔限制性与肌限制性细胞。妊娠可诱发具自我更新性与多能性的上皮细胞亚型PI-MEC。小鼠乳腺干细胞在青春期与妊娠期分别由雌激素与孕激素调控。乳腺干/祖细胞的自我更新与分化受Wnt、Hedgehog 、Notch与TGF-beta等信号转导系统相关的诸多因素调控。

乳腺干细胞；再生；分化；信号调控

妇女乳腺的基本功能是哺乳，并以此为婴儿提供生存所必需的营养与某些免疫物质。母乳喂养促进亲子间的感情交流，且有助于母体的产后恢复，如子宫复旧。成年女性乳房是显现躯体性感与曲线美的重要器官之一。丰满挺拔的乳房具有迷人的美学意义，女性乳房也是易患多种疾病的器官。

在人体诸多器官中，乳腺的独特性主要为其发育是在出生后，并于青春期和妊娠期发生急剧增生和分化。在全身性激素，主要是雌激素及孕激素分泌消长的调控下，乳腺在月经周期及妊娠、哺乳与断奶、复旧及再次妊娠周期中发生周而复始的再生、分化与凋亡等改变。一般，器官与结构的干细胞对局部损害发生分裂反应，以弥补丧失的细胞。而乳腺则当青春动情期与妊娠的特别时期需要再生大量的细胞，以形成新的组织结构。这对乳腺干细胞及其局部微环境提出了特别的需求。

乳腺的实验研究广泛采用小鼠模型。或直接利用小鼠乳腺上皮，或间接地将人类乳腺上皮异种移植于小鼠，以观察人类乳腺生物学。从分析小鼠模型中，学者们获得了关于乳腺发育、癌变等方面的重要知识。但，小鼠与人类乳腺的发育、解剖与生理也存在某些显著的差异。例如，小鼠乳腺的上皮管道系统埋于脂肪垫内，而人类乳腺上皮的周围是胶原化间质；人类发育过程的乳腺上皮中有CK19阳性与CK14阳性的腔上皮，而小鼠则缺乏这种双阳性的腔上皮细胞。这些差异提示，从小鼠模型实验所获得的结果不宜简单地直接推论于人类乳腺。

1 乳腺发育

乳腺发育分为三个不同时相，即胚胎期、青春期和妊娠期/哺乳期。胚胎期人类和鼠类乳腺的发育十分相似。但人类乳腺发育比较复杂些，可分为十个阶段，包括乳嵴、乳丘、乳盘、小丘、圆锥、发芽、凹入、分支、成管与端—泡各期。最早，于胚胎龄4周、胚体4～5 mm长时，胚体躯干左右腹侧，自腋至腹股沟部各出现一条凸向中线的曲线，称为乳线（亦称乳纹或乳带）。人类乳带在胸壁产生一对乳嵴；在鼠类，乳带产生五对乳嵴。在人类和鼠类，乳嵴处的外胚层增厚，形成基板。继之，该部上皮发育为侵入间叶组织（小鼠为脂肪垫，人类为纤维间质）的原基上皮芽。人类乳腺始基大部分上皮细胞呈CK19与CK14双阳性，而小鼠乳腺者仅呈CK14阳性。原基上皮芽发育成管状导管，延伸并分支，终止于上皮增生活跃的杵状球形结构，即终端芽（TEB）。 TEB由多层体细胞（body cell）外覆单层帽细胞 （cap cell）构成。帽细胞是具旺盛细胞分裂及向腔上皮与肌上皮分化能力的细胞。体细胞为腔上皮的前身。小鼠10～12周龄时，乳腺导管树长至脂肪垫边缘后，TEB退化。人类青春期乳腺在全身性激素影响下，进一步发育，导管树继续延伸与分支，形成具有终末导管小叶单位（TDLU）或称乳腺功能单位的分支导管系统。在小鼠其乳腺小叶结构则至妊娠期才开始形成。

TDLU是由埋于小叶间质中的短距终端导管及由它生出的小导管构成的结构。Russo J 和Russo I H将人类乳腺小叶分为四型（Lob1, 2, 3, 4）。I 型小叶（Lob1）即所谓处女型乳腺小叶，其终端导管分出4～11个小导管。月经来潮后1～2年， Lob1发育成 II型小叶（Lob2），每个腺小叶的小导管数平均为47个。妊娠期，人类乳腺发生比较急剧的改变，Lob2演进为Lob3，每小叶的小导管数平均为81个。随着妊娠的进展，Lob3又日益转变为Lob4，每个腺泡的上皮分裂活跃且胞质增多。妊娠后期时，腺泡分泌活性日益增强，腺腔扩张，内含分泌物。哺乳时，乳腺腺体很少增生活动。随着乳房规律性地排乳，乳汁继续被合成并释入乳腺腺泡与导管系统。乳汁在导管系统内贮积若超过48 h，则导致乳汁的合成与分泌减少。

哺乳停止后，乳腺开始复旧。90%的腺上皮凋亡。退变的腺体成分被脂肪细胞取代。复旧的人类乳腺发生显著的形态学改变，至乳腺的形态如妊娠前的状态。但是，复旧的小鼠乳腺像处女小鼠的一样，仍保留着一些腺泡。

每一次妊娠都重复着自Lob2至Lob4而后复旧的改变。乳腺的再生有赖于乳腺干细胞的存在及其在诸多激素与信号调控下的对称性与不对称性的细胞分裂能力。正常乳腺干细胞在胚胎/胎儿发育过程、青春期和妊娠期特别具有增生活性，这也涉及动情周期腺体的有限性扩增[1～3]。

2 乳腺干细胞的发现

上世纪50～80年代，几组研究者（DeOme等1959， Daniel和Deome 1965，Deniel和Young 1971，Smith 和Medina 1988）先后进行乳腺再生的实验研究。实验分离小鼠乳腺上皮，进行有限稀释培养，获得细胞克隆，将其移植入已清除腺管系统的受体小鼠乳房脂肪垫。结果，再生出由腔上皮与肌上皮组成的导管腺泡枝条。他们发现，在小鼠乳腺发育的整个过程，自其任何一部分取样培养移植，均可分离出具有完全再生能力的细胞。Kordon和Smith （1998）进一步证明，自小鼠乳腺分离出以逆病毒标记的单个细胞克隆，移植后，可再生成完整的乳腺腺体。据评估，这些克隆化的干/祖细胞占乳腺上皮细胞的1/1000～2000。

Chepko和Smith（1997）在电镜下分析鼠类乳腺超微结构，观察到五种类型细胞，包括原始小亮细胞（SLC)、未分化大亮细胞（ULLC）、分化良好大亮细胞（DLLC）与大暗细胞（LDC）及典型分化细胞（腔上皮细胞与肌上皮细胞）。其中，小亮细胞约占上皮细胞的3%，它不与管腔接触、无极向、形如阿米巴、核小、细胞器少。并可见由SLC向ULLC与肌上皮分化的过渡型细胞。研究者们设想，小亮细胞包括干细胞和I级祖细胞。

正常乳腺干细胞可处于不分裂的静息状态。将标记的DNA前体，如氚化胸腺嘧啶核苷或溴脱氧脲核苷作为标记物，注入小鼠后，标记物可长期保存于干细胞内。多个研究组利用这个手段来发现乳腺干细胞。例如，Smith（2005）用 [3H]-胸腺嘧啶（3HTdR）标记小鼠的移植乳腺组织。追踪3～4周后，第二次注射BrdU标记，在乳腺组织中可见到很大比例的3HTdR细胞结合了BrdU。追踪观察，子代细胞中BrdU标记减少，而3HTdR则继续保存。

人类正常乳腺新生上皮源于共同细胞的最初证据来自对X-染色体灭活型的分析。胚胎发育的种植前阶段，胚细胞发生随机性父方或母方X染色体灭活，从而给其后代细胞留下永久性标记。因此，通过分析X联系基因多态性DNA标记的甲基化状态，可评估组织的克隆形成能力。Tsui等分析DNA甲基化状态类型，证实人类乳腺整个小叶和大导管中，均散在有具相同X染色体灭活细胞组成的区域。

Clarke等把[3H]标记的人类乳腺上皮细胞移植于无胸腺裸鼠，发现两周后有7～9%的细胞保留[3H]标记。这些细胞表达所设想的干细胞标志p21CIP/ WAF和Husashi-1（RNA结合蛋白）。

利用活体移植证实，人类乳腺干细胞的存在需要克服异体移植障碍。Kuperwasser等利用免疫受损小鼠建立活体正位异种移植模型。他们把取自人类乳腺的纤维母细胞与乳腺上皮细胞植入受体裸小鼠，观察到在人类化的间质中，人乳腺细胞新生成了形态与分化均呈正常情况的乳腺[1～4]。

3 识别乳腺干细胞常用的方法

3.1 细胞表面标记：包括细胞角蛋白、整合素与黏附因子成员、干细胞抗原-1等。

（1） CK：乳腺分化性腔上皮表达CK8/18/19，肌上皮表达CK14与SMA。活跃增生的上皮细胞表达CK6。Böcker等发现尚有一种表达CK5，而CK8/18/19与SMA均呈阴性的细胞，它可经过CK5/8/18/19或CK5/SMA阳性的中间阶段演变为腔上皮细胞或肌上皮细胞。

（2） 整合素成员CD49f与CD29，黏附因子成员CD44与CD24：从小鼠乳腺分离纯化的CD49fhighCD24medLin–或CD29highCD24+Lin–细胞系，位于腺管的基底层。将其单细胞移植，可形成完全的乳腺组织。CD44+CD24-/lowLin–也具有同样自我更新与双向分化能力。提示，这类细胞亚群具干细胞性质。

（3） Sca-1（干细胞抗原-1，Ly-6a）：这是一种磷脂酰肌醇—锚定膜蛋白。在小鼠骨髓与肌的干细胞表达。将经荧光激活细胞分选（FASC）法分离的Sca-GFP+细胞，或经磁珠分选法分离的小鼠乳腺Sca+细胞植入已清除腺组织的小鼠乳房脂肪垫后，可产生乳腺支条。提示该Sca+细胞亚群中含有干细胞。但是，Shackleton等和Stingl等报道，高度纯化的乳腺干细胞呈Sca-1低表达，而且，在人类基因中未发现Ly-6a同源物。

3.2 乙酰脱氢酶（ALDH）

ALDH超家族包括19种同功酶，位于细胞质内，可使乙酰脱氢氧化成乙酸，从而保护细胞以避免醛过氧化物的损害。认为ALDH高表达是一群具干/祖细胞性质细胞的特征。从人类乳房缩减手术所取得的乳腺样品中分离的ALDHbr细胞与未分类细胞比较，前者乳腺球的形成率高20倍。将ALDHbr细胞移植于乳腺脂垫后，形成未定型肌上皮、腔上皮和二者混合的集落及导管；而ALDHdim细胞群仅形成腔上皮细胞。认为细胞内ALDH高活性是干细胞的特征之一。ALDHbr细胞群已从人类的血液、骨髓、肌肉与乳腺，及啮齿类的脑、胰与前列腺拣选出来。

3.3 Sp分析

细胞膜具有多药转运泵。Bcrp的细胞可以排出外来有毒物质。体外培养的乳腺干细胞表达Bcrp，它能排除加入培养基中的细胞毒性Hoechst3342，而得以存活。这种存活的细胞与其它被毒杀的细胞呈不同的荧光着色，因而可加以识别。排除Hoechst3342的细胞称之为Sp（side population）细胞，据称，它们占乳腺上皮干细胞的1/5～1/10。

3.4 体外培养乳腺球

Dontu等应用类似Reynolds和Weis体外培养神经细胞球的方法，自乳房复原成形术切除的乳腺组织中分离人类乳腺上皮细胞，将其置于含EGF和（或）bFGF的无血清培养基中，在非黏着性底物上培养，所培养的细胞中绝大多数发生失巢凋亡（anoikis）。但在每1000个分离出的细胞中约有4个细胞能生存并繁殖形成多细胞球—乳腺球，它们是富含CD49f+，CK5+和CD10的未分化细胞，也有很少数表达腔上皮标记CK14的细胞。所培养的未分化细胞经多次传代仍保持原来的未分化状态。而在培养基中加入促分化的胶原底物后，形成表达导管上皮与肌上皮的集落。在重建3-D培养系统的matrigel，乳腺球所含细胞能克隆出与导管和腺泡相似的分支结构。Dontu等用FACS从未经体外培养的乳腺上皮中分离出Sp与非Sp细胞，发现其中仅Sp组分能形成乳腺球，并产生多谱系细胞集落及在NOD/SC2D小鼠乳房脂肪垫形成乳腺上皮支条。这类支条具有人类乳腺导管腺泡结构及其组成细胞成分的特征[1,2,4,5]。

4 乳腺干/祖细胞级别分化系统

Gudjonsson等[7]应用流式细胞计和HPV E6E7永生化技术，从人类乳腺分离出分别表达干细胞标记MUC1–/ESA+(E6/E7)和系限制性标记MUC1+/ESA+(E6/E7)的两个细胞系，前者为永生化克隆性，产生具亲代原有特性及呈腔上皮与肌上皮表型后代，并在3D1rECM上形成终末导管小叶单位样结构。后者则在3D1rECM上只形成腺泡样结构。Villadsen等[8]利用体外非粘着性乳腺球形成,细胞谱系HPVE6/E7转导,荧光激活细胞拣选（FACS）分析和克隆化，结合免疫化学、RT-PCR和RS-PCR等技术，从人类乳腺分离得4个细胞系，其中表达干细胞标记SSEA4hi/CK5/ CK6a+/CK15+/Bcl+的细胞与位于乳腺导管干细胞带的CK19+/CK14+/CD49f+Lin–EPCAM+细胞属同类，具克隆性生长与自我更新能力。其它3个为分别呈腔上皮祖细胞与肌上皮祖细胞分化倾向的细胞系，位于干细胞邻近的远侧。

Stingl等[9]把小鼠乳腺上皮移植所生成的乳腺结构再分离，进行单细胞浮悬培养，检出由单个细胞增生所成组织学似正常乳腺的再繁殖单位（MRUs）生长物，其中含有CD49fhiCD24med细胞。高纯化的单个MRU可进行至少10代对称性细胞分裂。其子代细胞有呈CD49flowCD24hi标记的Ma-CFCs。Shackleton等[10]将自小鼠乳腺分离出的Lin–细胞系加以移植，按CD24和CD29表达情况分为4个亚群，其中Lin–CD29hiCD24+表达可使MRU增长8倍，连续三轮传代，保持原有特性。其它三个亚群则无此能力。将Rosa-26小鼠的Lin-CD24+CD29hi细胞浮悬液以每个注射量含一个细胞的浓度进行102次移植，有六次产生由腔上皮与肌上皮构成的导管结构。受体小鼠妊娠时，单细胞繁殖形成的腺泡导管内出现乳汁蛋白与脂滴，说明移植物充分分化。

Stingl等[11]从人乳腺分离单个细胞，将其在集落形成条件下浮悬培养，获得三类集落，包括腔限制性祖细胞、肌上皮祖细胞及具腔上皮与肌上皮双向功能祖细胞。据此，Stingl等设想，乳腺干细胞后代的级别分化，首先是双能祖细胞，继之，由双能祖细胞产生腔限制性与肌限制性细胞。

Van Keymeulen等[12]对发育中、成年与妊娠中小鼠进行谱系追踪和克隆分析，发现出生后未曾受干扰乳腺的腔上皮和肌上皮细胞谱系分别含长寿单能干细胞。这两类单能干细胞在乳腺形态发生期、成年与妊娠周期均显示大量克隆性扩增能力。Van Keymeulen等因而认为小鼠乳腺最初从多能性K14+前体细胞起始发育。这种前体细胞生成肌上皮与腔上皮。在青春期与内环境稳定时，肌上皮与腔上皮谱系的维持分别是靠能向肌上皮分化的肌上皮限制性与向腔上皮分化的腔上皮限制性干/祖细胞来保证的。

5 妊娠诱发乳腺上皮细胞亚型（PI-MEC）

未经产妇与经产妇发生乳腺癌的危险性存在差别，与妊娠所致乳腺上皮基因表达状态永久性改变相关。Ginger等比较经激素处理和未经激素处理的Wister-Furth大鼠乳腺，用减数杂交法鉴定二者基因表达的差别。于最末一次处理后28天，可识别100个呈不同表达的基因位点。D'Cruz用寡核苷酸阵列，比较经产小鼠与未经产小鼠乳腺上皮，观察到众多基因的表达谱差异。Boulanger应用Cre-lox技术，观察到在非哺乳未妊娠经产小鼠乳腺上皮富含一种上皮亚型。这种由经产诱发的乳腺上皮细胞（PI-MECs）永久性地定居于经哺乳改造的导管终端（即小叶腺泡单位）。PI-MECs具自我更新与多能性。把含有标记PIMECs的乳腺碎片植入未经产宿主已清除腺管的乳房脂肪垫，PI-MECs非常显著地使小导管延长。在75%以上的移植物中，自PI-MEC来源的细胞存在于整个腺体导管树。WAP-TGF-β1表达可中断PI-MECs在移植物中的自我更新[13]。

6 乳腺干细胞龛

调控干细胞的局部微环境称之为niches（壁龛或龛）。Chepko称，龛由信号细胞、特征性细胞外基质（ECM）、可溶性介质和干细胞组成。乳腺干细胞及其龛的部位目前尚未完全确定。有证据表明，小鼠乳腺导管发育时，其终端芽（TEBs）帽区可能是干细胞龛的所在之处。但当导管树发育完全后，TEBs和帽细胞不再存在。可见，此结构并非成年乳腺干细胞龛的所在之处。Sonnenberg等发现小鼠乳腺导管（而非腺泡）的细胞可再生导管与腺泡芽，因此设想导管的这类细胞为干细胞。从小鼠任一部位取组织移植均可产生完整结构—能泌乳的乳腺。这一事实说明乳腺干细胞龛以规则地间距分布于整个乳腺。Villadsen等从乳腺缩减成形术的乳腺中收集样品进行显微切割。证实终末导管是成年人类乳腺干细胞的主要部位之一。从这些部位分离的细胞具SSEA-4、CD49f、CK^等干细胞标记表达，经体外无血清非粘着性培养产生自我更新乳腺球，2D培养产生多谱系集落，3D ECM培养产生TDLU样结构。

Danial和Deome等所作移植实验证明小鼠乳房脂肪垫与人类纤维母细胞分别是小鼠和人类含乳腺干细胞移植物生长的必要条件。提示，间质是乳腺干细胞龛的组成成分。

Boulanger等[14]把成年小鼠睾丸输精小管内具遗传标记的生精细胞与乳腺上皮单细胞悬液混合后，注入清除腺体的乳房脂肪垫，发现重新程序化的睾丸细胞生成乳腺结构。Nishimura等及Collin等发现干细胞被实验性清除后，其子代定向祖细胞可迁入空龛定居，并获得干细胞功能。这类实验表明，干细胞的干性是由龛所决定的。

乳腺干细胞为ERα阴性。它的增生需要龛内ERα阳性细胞（“感觉细胞”）的旁分泌刺激。青春期小鼠乳腺导管呈指数扩增，此时雌激素诱导“感觉细胞”合成分泌amphiregulin （EGF家族成员）。Amphiregulin被激活后，作用于EGFR阳性的间叶细胞，可能是这些细胞释出增生信号，或TGFβ抑制物，解除TGFβ对乳腺增生的抑制作用。增生信号或增生抑制解除，从而激发龛内干细胞分裂活动，使导管延长。

孕酮在性成熟后取代雌激素，也以旁分泌方式来刺激受体阳性和阴性的乳腺腔上皮增生，形成乳腺小导管侧支与腺泡。介导孕酮旁分泌效应的是 RANKL和Wnt4。RANKL由腔系细胞分泌，其受体RANK由干细胞群表达（Asselin-Labet等2010）。这意味着腔上皮细胞是干细胞龛的成分。Wnt4信号被认为是直接作用于龛内干细胞，激发其不对称核分裂，从而控制干细胞自身的繁殖。

综上所述，小鼠乳腺干细胞在青春期是由雌激素调控，而妊娠期则由孕酮调控。

Wnt信号丧失伴有乳腺发育缺陷。应用Wnt活性报告者小鼠证实，乳腺管道系统几乎所有分支呈Wnt阳性染色反应，尤为重要的是，Wnt活性是从导管基底层，即乳腺干细胞龛所在处检出的。应用基因组转录子分析显示TEB富含Wnt-2、4、5a、5b、6和7b。小鼠成熟期乳腺导管仅富于Wnt-4、5b和6。 Wnt-2、5a和7b在处女期小鼠乳腺强表达，妊娠期下调。反之，妊娠期诱发Wnt-4、5b和6表达。

Hedgehog信号介导乳腺发育过程中上皮—间质相互作用，影响细胞增生、分化与器官形成模式。每一器官结构的正常发育均需Hh信号转导网络的适当调控，但并非任何情况下都需Hh激活。Ihh和Dhh在青春期乳腺表达，妊娠/哺乳期仅Ihh上调；敲除实验提示，对于乳腺形成hh并非不可缺少。单一Ptch-1（Hh受体）不足，可引起导管增生与结构不良。发育各期的乳腺上皮均有Gli2和Gli3表达。Gli2裸鼠乳腺组织产生不正常分支与扩张状态的导管。

Notch信号促进乳腺干/祖细胞自我更新。Notch信号转导通路活跃可使体外培养乳腺球形成率与双能CFC生成率提高，及三维matrigel培养支条形态发生增强。反之，用阻抑Notch信号的抗体可完全消除继发性乳腺球形成。Notch-1和-3在正常乳腺的腔细胞表达。在腔限制性集落形成细胞，Notch-3表达增强。抑制Notch-3足以阻止体外双能性集落细胞生成腔上皮。Notch-4在基底层和肌上皮区间，即乳腺干细胞所在处表达。Notch-4的结构性活化形式过表达，在体外，可抑制正常乳腺上皮分化。在活体，使转基因小鼠正常乳腺分支形态与腺泡结构不能形成。

TGFβ在调节乳腺干细胞动力学、维持其未分化状态和建立特有的乳腺结构方面具关键性作用。在体内、体外，TGFβ是乳腺上皮增生强有力的抑制剂，而对间叶源细胞则有明显激活作用。TGF-β3存在于终末芽帽细胞和上皮细胞内。TGFβ1则存在于非生长期导管周围基质内。TGFβ在乳腺导管树建立后能抑制侧支芽发生[2,5,15,16]。

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Identification, regeneration, differentiation and regulation of breast stem cell

ZHANG Zhong★, LI Lianhong, XIE Fengpei
(Department of Pathology, Dalian Medical University, Liaoning, Dalian 116044, China)

The development and regeneration of the breast depend upon the proliferation of the breast stem cell (BSC). BSCs with their niches are in the cap areas of the terminal end buds (TEBs) in the primordial duct system of the breast rudimentum in embryos, and distributed with regular interval in the duct system, mainly in the terminal duct areas of the adult breast. The BSCs may be identified by using phenotypic markers, Sp analysis and mammosphere formation in vitro. The hierarchy-differentiation of the progeny of BSC is firstly bipotential progenitors, then, lumen-restricted and myo-restricted cells. Pregnancy can induce PI-MEC with selfrenewal and multipotential ability. The BSCs in puberty and pregnancy are controlled separately by estrogen and progesterone. The self-renewal and differentiation ability of the stem cells or the progenitors of the breast epithelium are controlled by some factors of several signal transduction systems, such as Wnt, Hedgehog, Notch and TGF-beta etc.

Breast stem cell; Regeneration; Differentiation; Signal control

大连医科大学病理学教研室，辽宁，大连 116044

★通讯作者：张众，E-mail:kcz_zhang@yahoo.com.cn