姜黄素拮抗环磷酰胺致小鼠正染红细胞微核形成的初步研究*

刘效筠，靳　怡

(1.湖北省黄石市中心医院,黄石　435000；　2.湖北省黄石市疾病控制中心，黄石　435000)

环磷酰胺(CPP)为氮芥与磷酰胺基结合而成的化合物，是临床常用的烷化剂类免疫抑制剂，可用于治疗各种自身免疫性疾病，即能抑制细胞增殖，非特异性杀伤抗原敏感性小淋巴细胞，限制其转化为免疫母细胞。

临床运用中发现，环磷酰胺具有较大的毒副作用，如有明显的胃肠道反应；大剂量使用可导致血小板减少，甚至贫血；高浓度使用时，易造成出血性膀胱炎；抑制卵细胞发育，影响生育。遗传毒理学研究表明，环磷酰胺对人体遗传物质具有很强的致突变性，常导致染色体的结构畸变。因此，在我国的中草药资源中积极寻求和使用环磷酰胺诱变药物或药物活性成分，减少环磷酰胺的毒性，并提高其用药安全是非常重要的。

姜黄素(curcumin)是从姜黄的根茎中提取的一种天然有效成分，属多酚类化合物，结晶状粉末，呈橙黄色。分子式为C21H20O6，相对分子质量为368.39。姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤和抗突变等广泛的药理作用，是当今国际上重点研究的天然成分之一[1,2]。

1　材料与方法

1.1试验仪器和材料

1.1.1受试药物姜黄素(分析纯浙江省温州市东升化工试剂厂，批号20110613)；注射用环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司，批号20111022)。

1.1.2实验动物昆明种白色小鼠清洁级40只，体重20～25 g，雌雄各半，湖北中医药大学提供。

1.1.3主要仪器与器材普通光学显微(9SE-Z型日本NIKON 公司);数码相机(IXUS-60型日本CANON 公司。

1.1.4主要试剂甲醇(methanol)，吉姆萨染料(Giemsa stain)，酸缓冲液(phosphate buffer solution)。

1.2方法

1.2.1分组及给药方法

1.2.1.1姜黄素混悬液的配制 姜黄素易溶于有机溶剂，而在水中的溶解度很低，本实验利用淀粉混悬液加入姜黄素进行充分混匀配制成姜黄素淀粉混悬液。

1.2.1.2分组情况 将40只小鼠平均分五组，分别为CPP组、高剂量组、中剂量组、低剂量组和空白组，每组各有8只小鼠。

1.2.1.3给药方法高剂量组200 μg/g·d-1、中剂量组100 μg/g·d-1、低剂量组50 μg/g·d-1，按各组剂量要求，以不同浓度姜黄素淀粉混悬液给小鼠连续灌胃6 d，1次/d，0.5 ml/次；空白对照组与阳性对照组灌服等量的淀粉混悬液。于第6 d灌胃后，CPP组与高、中、低三个剂量组小鼠腹腔注射浓度为0.4 mg/ml的环磷酰胺1 ml，空白对照组注射生理盐水1 ml。

1.2.2微核标本的制备采用涂片法制备小鼠外周血正染红细胞的微核标本，事先准备好80片用玻璃笔刻制有组别标记的载玻片。①取材：分别于注射环磷酰胺24 h与48 h后，用剪刀剪去小鼠尾部末端1 mm。②制片：将尾血挤出，滴在载玻片上，然后推片约3～5 cm。③固定：涂片自然干燥后，放在甲醇中固定10 min。④染色：干燥后的涂片用Giemsa工作液(1份吉姆萨原液与9份磷酸缓冲液混匀，pH为7.2)染色5～10 min，清水冲洗，晾干并保存。

1.2.3微核的计数与观察用双盲法阅片，选择分布均匀，染色较好的区域，在油镜下计数小鼠正染红细胞微核。使用数码相机的典型标本显微摄影记录来拍摄标本。观察小鼠外周血微核标本为小鼠正染红细胞的微核。用吉姆萨染液染色后，正染红细胞呈橙黄色。典型的微核为紫色或紫红色，大小是红色的血细胞直径的1/20～1/3。边缘光滑整齐，圆形，单一，嗜色性和核质相同。以1000为每只动物选取的总细胞计数数，观察并记录细胞中含有的微核数，用千分率来表示微核率。微核率=含微核的正染红细胞数/观察的正染红细胞数×1000‰。

1.2.4统计学处理 各组实验数据以均数±标准差表示，各剂量组间的比较用方差分析，对微核率进行直线相关性分析。利用SPSS 13.0统计软件对各组数据进行统计学处理。以P<0.05为差异有显著意义。

2　结果

24 h与48 h小鼠外周血正染红细胞MN实验结果见表1。

表1　24 h与48 h小鼠外周血正染红细胞MN实验结果

注：CPP组、高剂量组、中剂量组和低剂量组与空白组比较，*P<0.05；48h与24h比较，△P<0.05

3　讨论

微核(MCN)是指位于细胞浆中独立于主核的核小体,主要由外界损害因素作用细胞后,导致细胞染色体丢失或断裂,从而在胞浆中形成1 个或数个小核[3]。因此在染色体遗传性疾病和癌症的早期诊断等方面，微核试验是一种理想的方法。 环磷酰胺具有较大的毒副作用，遗传毒理学研究表明，环磷酰胺对人体遗传物质具有很强的致突变性，常导致染色体的结构畸变。已经研究确认，环磷酰胺能够诱导细胞产生微核，这是在染色体畸变情况下产生的效果。

对细胞进行计数显示用0.4 mg/ml环磷酰胺处理24 h后，CPP组的小鼠正染红细胞微核率为(9.83±0.28)‰，而姜黄素低剂量组降低至(8.13±0.31)‰，姜黄素中剂量组降低至(6.24±0.24)‰，姜黄素高剂量组降低至(4.39±0.21)‰，由此可见，在不同浓度梯度的姜黄素组中，可以明显地观察到姜黄素剂量越高，其相应分组的微核率越低。将对照组与CPP组对比显示，CPP组细胞经环磷酰胺诱导后微核率明显高于对照组。同理分析48 h数据亦可发现相同量效关系。比较24 h与48 h实验数据，随着时间推移， 48 h各组微核率横向比较均高于24 h。本实验结果证实，姜黄素对CPP诱导小鼠正染红细胞微核的产生有抑制作用，且抑制作用与姜黄素的浓度梯度成正相关。

本研究发现，姜黄素能够拮抗环磷酰胺诱导小鼠正染红细胞微核的产生，减少环磷酰胺的遗传物质致突变性及毒性，并能辅助提高环磷酰胺的临床用药安全。

1MIGUEL LOPEZ-LAZARO. Anticancer and carcinogenic properties of curcumin:Considerations for its clinical developmeng as a cancer chemopreventive and chemotherapeutic agent[J].Mol Nutr Food Res,2008,52：103

2MAHESHWARI R K,SINGH A K,GADDIPATI J,etal.Multiple biologicl activities of curcumin:A short review[J].Life Sciences,2006,78(18)：2081

3曹佳,林真,余争平.微核试验——原理、方法及其在人群监测和毒性评价中的应用[M]. 北京:军事医学科学出版社,2000 :1-9