初发系统性红斑狼疮患者调节性T细胞和Th17细胞的检测及意义

2013-04-18马纪林刘小贤汪卫郑红霞蔡龙施华萍周红娟于健宁

浙江医学 2013年20期

马纪林刘小贤汪卫郑红霞蔡龙施华萍周红娟于健宁

●论著

马纪林刘小贤汪卫郑红霞蔡龙施华萍周红娟于健宁

目的观察初发系统性红斑狼疮（SLE）患者外周血调节性T细胞（Treg）和Th17细胞的变化，探讨其临床意义。方法检测15例初发SLE患者（活动组11例，非活动组5例）及10例健康对照者（对照组）的外周血CD4+CD25highTreg、Th17细胞占CD4+的比例，分析两种细胞的比率与疾病活动指数（SLEDAI）的相关性。结果初发SLE患者外周血CD4+CD25highTreg和Th17细胞的比例与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0．05），与SLEDAI无相关性（均P＞0．05）。CD4+CD25highT细胞与Th17细胞的比率在活动组患者下降尤为明显（P＜0．05），且与SLEDAI呈明显的负相关（P＜0．05）。结论初发的活动性SLE患者外周血Treg与Th17细胞的比率明显下降，并与疾病活动密切相关，两群细胞的失衡可能在SLE发病机制中起重要的作用。

红斑狼疮系统性调节性T细胞 Th17细胞

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是具体病因尚未明确的一种常见的自身免疫性疾病，临床特征为抗原-抗体的免疫复合物沉积于器官引起多种临床表现。免疫系统紊乱在SLE发病中占主导地位。调节性T细胞（regulaory T cells，Treg）和Th17细胞是新近发现的两群CD4+T细胞亚群，其中Treg具有免疫抑制和免疫无能的特征，可“主动”地抑制免疫反应[1]。Th17细胞为促炎症细胞，通过分泌IL-17A和IL-17F，引起组织的免疫炎症[2-3]。两群细胞间的失衡导致自身免疫病的发生[4]。我们在前期研究中发现Treg与Th17的失衡在活动性SLE中明显降低，并与疾病明显相关，但在初发SLE患者中的作用尚不明确[5]。本研究采用流式细胞仪检测初发SLE患者外周血CD4+CD25high-Treg和Th17细胞占CD4+细胞的比例，分析两者的比率与疾病活动的相关性以及Treg与Th17细胞的免疫失衡在初发SLE发病机制中的作用。

1 对象和方法

1.1 对象我院风湿免疫肾脏科2008-09—2011-12住院或门诊收治未经治疗的初发SLE患者15例，男1例，女14例，年龄22～38岁。诊断均符合1997年美国风湿病学会制定的SLE诊断标准。采用SLE疾病活动指数（SLEDAI）将其分组（SLEDAI≈6分为活动组，＜6分为非活动组），其中活动组10例，SLEDAI为（14.70±5.12）分，非活动组5例，SLEDAI为（2.60±1.14）分，两组评分比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。选择同时期体检的健康者10例为对照组，男1例，女9例，年龄20～37岁。两组性别、年龄差异均无统计学意义（均P＞0.05）。本研究遵循伦理学标准，并得到本单位医学伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 CD4+CD25highT细胞的培养与标记取肝素抗凝全血3ml，分别加入20μl的PE标记的鼠抗人CD4单抗和异硫氰酸荧光素（FITC）标记的鼠抗人CD25单抗，并设立同型对照管。混匀后避光15min，再加入1ml红细胞裂解液，37℃孵育10min，离心弃去上清液，PBS洗涤3次。

1.2.2 Th17细胞的培养与标记空腹抽取初发SLE患者和健康对照组静脉血，肝素抗凝，调整细胞浓度为1× 106个/ml，接种至24孔培养板，每孔加入的50ng/ml佛波酯和750ng/ml的离子霉素，孵育1h后加入10μg/ml莫能霉素，在37℃，5%CO2细胞培养箱孵育4h后收集细胞，取500μl细胞于流式专用试管中，分为测定管和同型对照管，加入20μl的PE标记的鼠抗人CD4单抗，4℃避光孵育30min，PBS洗涤2次，固定液室温避光固定反应20min后离心弃去上清液，PBS洗涤2次。加入破膜剂进行细胞打孔，离心弃去上清液后进行细胞因子染色。测定管加入0.5μl FITC标记的IL-17A，对照管加入同型对照，4℃避光孵育30min。藻红素（PE）标记的鼠抗人CD4，FITC标记的鼠抗人CD25及同型对照均购自美国BD公司，FITC标记的鼠抗人的IL-17A及同型对照购自美国eBioscience公司。佛波酯、离子霉素和莫能霉素均购自美国Sigma-Aldrich公司，RPMI 1640购自美国Gibco公司。

1.2.3 流式细胞仪检测 Epics XL-MCL型流式细胞分析仪（Beckman-Coulter公司），按常规操作进行，EXPO32软件分析结果，根据正向散射光和侧向散射光以淋巴细胞群设门，分别测定SLE患者和健康对照组CD4+CD25highT细胞和Th17细胞占CD4+T细胞的比例，其中CD4+CD25highT细胞定义为2倍于CD4+CD25+T细胞的平均荧光强度的细胞（图1）。

图1 流式检测CD4+CD25highT细胞的设门

1.3 统计学处理采用SigmaStat3.5统计软件。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析（AVONA），两组间比较采用t检验，变量间的相关关系采用Pearson相关分析。

2 结果

初发SLE患者及对照组外周血CD4+CD25highTreg细胞与Th17细胞的比率及与疾病的相关性见表1。

由表1可见，初发SLE组和对照组外周血CD4+CD25highTreg细胞的比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。其中在初发SLE患者中，活动组和非活动组外周血CD4+CD25highTreg细胞的比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。活动组和非活动组SLE与对照组比较，差异也无统计学意义（P＞0.05）。初发SLE患者外周血CD4+CD25highT细胞的比例与SLEDAI无相关性（r=-0.403，P＞0.05，图2A）。

表1 初发SLE组与对照组的Treg和Th17细胞的比例及两者的比率

初发SLE组和对照组外周血Th17细胞的比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。其中在初发SLE患者中，活动组、非活动组外周血Th17细胞的比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05），活动组、非活动组与对照组比较，差异也无统计学意义（P＞0.05）。初发SLE患者外周血Th17细胞的比例与SLEDAI无相关性（r= 0.471，P＞0.05，图2B）。

图2 CD4+CD25highT细胞（A）和Th17细胞（B）与SLEDAI的相关性分析

初发SLE组和对照组外周血CD4+CD25highTreg细胞与Th17细胞的比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。其中在初发SLE患者中，活动组、非活动组外周血CD4+CD25highTreg细胞与Th17细胞的比率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），与对照组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。初发SLE患者CD4+CD25highTreg细胞与Th17细胞的比率与SLEDAI呈负相关性（r=-0.527，P＜0.05，图3）。

图3 CD4+CD25high/Th17细胞比率与SLEDAI的相关性分析

3 讨论

本研究发现Treg与Th17细胞的比率在初发的活动期SLE患者中下降明显，并与SLEDAI呈密切相关，但未发现Treg和Th17细胞占CD4+T细胞的比例在初发SLE的异常及与疾病活动无相关性，揭示Treg与Th17细胞之间的免疫失衡在初发SLE组发病中起到一定的作用。

SLE是一种常见的自身免疫性疾病，累及多个器官导致一系列的临床表现，其发病机制主要是免疫耐受的失衡，机体产生大量的自身抗体，导致抗原抗体复合物形成。免疫系统的稳定需要免疫耐受来维持，免疫耐受可分为中枢性和外周性免疫耐受。Treg是一群能够“主动”地抑制自身反应性T细胞的免疫反应，抑制细胞的活化和细胞因子的分泌[1]，是维持外周免疫耐受的最重要机制。1995年，Sakaguchi等[6]首次定义高表达IL-2受体α链（CD25）的CD4+T细胞为Treg，其在体外通过细胞间的直接接触发挥免疫抑制作用，在体内可能还通过细胞因子发挥其功能，随着研究的不断深入，发现多箭头转录因子Foxp3是小鼠Treg的标记物和功能调节基因[7]，然而，在人活化的T细胞中也能短暂表达Foxp3[8]，说明其不是人Treg的特异标记物，目前仍认为CD4+CD25highT细胞是人较特异的标记物[9]，因此本研究选择此群细胞来定义Treg。Th17细胞是一群促炎症细胞，能分泌IL-17A、IL-17F及IL-21，导致组织的炎症反应。在体外由TGF-β和IL-6诱导产生Th17细胞，其中维甲酸孤儿核受体RORγt是Th17细胞分化的重要因子[2-3]。Treg和Th17细胞在自身免疫性疾病中的作用越来越受到重视，如类风湿关节炎，多发性硬化等。

本研究发现初发SLE组Treg占CD4+T细胞的比例并不降低，与SLEDAI无相关性。已有大量的研究发现在活动性SLE患者外周血Treg的数目减少[9-10]，但有少数研究发现其比例是正常的[11]，相反的，也有研究发现活动性SLE患者的Treg是上升的[12]。以上结果说明Treg在SLE中的作用不尽一致，可能与Treg的标记物选择有关。接着我们分析初发SLE患者外周血Th17细胞的比例，同样也未发现有临床意义。Wong等[14]发现SLE患者Th17细胞在活动期明显增加，并与SLEDAI呈正相关。最近的研究发现Th17细胞在SLE中有一定的作用，但是确切机制尚不明确[15]。

本研究中的重要发现是初发的活动性SLE患者存在Treg和Th17细胞的比率明显下降，与疾病活动呈明显的负相关。Yang等[16]也发现活动性SLE患者存在Th17细胞的扩增，且伴随Treg的下降，我们的前期研究[17]发现经治疗后临床缓解的活动性SLE患者的SLEDAI明显下降，伴随Treg和Th17细胞的失衡被逆转。以上结果表明Treg与Th17细胞的免疫失衡是初发活动性SLE的临床特征和参与其发生和发展。Treg和Th17细胞的分化存在相互制约，例如IL-6联合TGF-β能诱导Th17细胞的分化，而IL-6抑制Treg的体外抑制功能。同样，IL-2是Treg诱导的必需细胞因子，也是维持Treg功能的重要因素，相反IL-2能抑制Th17细胞的分化[21]。因此，我们认为初发SLE患者存在异常的免疫环境导致Treg和Th17细胞的失衡。

综上所述，我们发现初发活动性SLE患者存在Treg与Th17细胞的比率降低，可辅助作为判断疾病活动的指标。两群细胞间的免疫失衡参与初发SLE的发生和发展。本研究的结果提示我们可以通过调控Treg和Th17细胞的平衡来治疗SLE等自身免疫性疾病。

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Clinical significance of regulatory T cells and Th17 cells in the patients with new-onset systemic lupus erythematosus

Objective To determine the ratio of CD25 and IL-17A cells in peripheral CD4+T cells of new-onset patients with systemic lupus erythematosus(SLE)and to assess their clinical significance．Methods Fifteen new-onset patients with systemic lupus erythematosus,including 10 active cases and 5 inactive cases,and 10 healthy individuals were enrolled in the study．The ratio of CD25 and IL-17A cells in peripheral CD4+T cells was analyzed by flow cytometry．Disease activity was assessed by systemic lupus erythematosus activity index(SLEDAI)．Results There was no significant difference in frequency of CD4+CD25highT cells and Th17 cells between SLE patients and normal controls(P＞0．05)．The frequency of CD4+CD25highT cells and Th17 cells was not correlated with SLEDAI scores of patients(P＞0．05)．The ratio of CD4+CD25highT cells and Th17 cells in active SLE patients was significantly lower than that in inactive patients and healthy controls (P＜0．05)and it was negatively correlated with SLEDAI scores(P＜0．05)．Conclusion The results indicate that the imbalance of Treg cells and Th17 cells may be involved in the pathogenesis of SLE．

Lupus erythematosus Systemic Regulatory T cells Th17 cells