发酵支原体和梨支原体致死性感染小鼠胸腺细胞 Fas/FasL表达与多器官损伤

温秀姝 沈丹丹 周丽萍

发酵支原体和梨支原体致死性感染小鼠胸腺细胞 Fas/FasL表达与多器官损伤

温秀姝 沈丹丹 周丽萍

目的 探讨发酵支原体（Mf）和梨支原体（Mpi）感染小鼠胸腺细胞Fas/FasL表达与多器官损伤相关性。 方法 55只清洁级ICR小鼠，分实验组24只（免疫抑制Mf、Mpi感染组）及对照组31只（非免疫抑制Mf感染和NS组）。感染组分别腹腔注射0.3ml Mf和Mpi标准菌株（6×108-9/ml），NS组注入相同量0.9%氯化钠注射液。计算各组小鼠死亡率，取其血清进行支原体再培养，免疫组化法分析小鼠胸腺细胞Fas/FasL的表达，电镜观察死亡小鼠心、肺、肝和肾的超微结构变化。 结果 实验组小鼠在感染3～5d后100%死亡（24/24），与非免疫抑制Mf感染对照组比较有统计学差异（P＜0.01）。胸腺细胞Fas/FasL高表达与心、肝、肺和肾等多器官损伤相一致。 结论 Mf或Mpi感染小鼠胸腺细胞Fas/FasL高表达与心、肺、肝和肾多器官损伤相关。

发酵支原体 梨支原体 胸腺 多器官损伤 Fas/FasL

Mycoplasma fermentans Mycoplasma pirum Thymus Multiple organ injury Fas/FasL

发酵支原体（Mycoplasma fermentans，Mf）、梨支原体（Mycoplasma pirum，Mpi）因在HIV感染者和AIDS患者体内成功分离而被称为艾滋病相关支原体。国内外研究[1]表明,此两种支原体的协同感染可能加速AIDS患者器官衰竭的发生。而多器官功能不全综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）是AIDS患者快速死亡常见原因。

穿通支原体和猪鼻支原体慢性感染能抑制p53基因，激活NF-kB并与ras基因协同促使细胞转化，与肿瘤的发生、发展相关[2]。然而,Mf（Mpi是Mf的变种）作为新的致死性感染病原体，致病机制与穿通支原体和猪鼻支原体不同。Mf感染后致患者器官暴发性广泛坏死，最明显的是肺、肝，脾、淋巴结、肾上腺，心脏和脑。在电镜下可证实患者器官组织细胞内存在支原体颗粒，采用单克隆抗体免疫组化分析检出发酵支原体DNA[3]。前期研究中通过动物实验证实大鼠或孕鼠感染此两种支原体后3～5d死亡[4-5]，死亡大鼠、孕鼠和仔鼠的心、肝、肺和肾等多器官坏死、空泡化，并在实验组的鼠肺、或孕鼠肝以及仔鼠的脑组织中电镜下验证支原体颗粒。本实验试图探讨Mf和Mpi感染与胸腺细胞凋亡调控基因Fas/FasL表达的关系以及与心、肝、肺、肾等多器官损伤相关性，为Mf和Mpi的致病机制研究提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 55只6周龄清洁级ICR雌性小鼠（16～20g/只）由温州医学院动物中心提供。

1.1.2 标准菌株与实验试剂 标准菌株Mf（ATCC19989）、Mpi（ATCC25960）；改良的SP4液体培养基和固体培养基，制备见参考文献[4-5]；环磷酰胺（0.2g/瓶）购自江苏恒瑞医药股份公司（批号10052621）；SP试剂盒、DAB显色剂和苏木素购自北京中杉金桥有限公司；兔抗鼠Fas和FasL多克隆抗体购自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 方法

1.2.1 标准菌株的复苏 见参考文献[4-5]。

1.2.2 实验动物分组及模型的制备 55只ICR小鼠中35只预先免疫抑制[隔日腹腔注射环磷酰胺50mg/（kg· d×5）次制成免疫抑制模型]，分免疫抑制Mf、Mpi感染组各12只，免疫抑制NS对照组11只；另20只非免疫抑制Mf感染组12只，NS对照组8只。动物模型的制备，见参考文献[4-5]。

1.2.3 死亡率比较 观察各组小鼠情况，记录死亡数及时间，比较死亡率。

1.2.4 血清采集再培养 各组死亡小鼠心脏采血，2500rpm离心20min，取上层血清无菌接种于SP4培养基，置于37℃5%CO2培养箱中，每天观察至颜色变化至黄色（一般3～5d），即为可疑“阳性”。再将培养物接种至固体培养基（肝消化汤琼脂），置于37℃5%CO2培养箱中孵育48h，若高倍镜下出现典型“油煎蛋”样菌落即可确认为支原体再培养阳性。

1.2.5 Fas/FasL凋亡蛋白的检测 分别取各组死亡小鼠胸腺组织1cm×1cm×1cm，经4%多聚甲醛固定过夜后，按常规方法制成蜡块，连续切片，片厚4μm。采用SP法进行常规的免疫组化染色，一抗为兔抗鼠Fas多克隆抗体（1∶200）和兔抗鼠FasL多克隆抗体（1∶200），二抗为山羊抗兔IgG，石蜡切片脱蜡至水，免疫组化检测采用高压抗原修复及SP染色法，具体操作按试剂盒说明书进行，DAB显色剂室温下显色，苏木素复染，阴性对照用PBS替代一抗，其余步骤同上。结果判断：400倍光镜下观察以胞质及胞膜被染成棕黄色或棕褐色者为阳性细胞，每张切片随机选取3～5个代表性视野，用Nikon E-800照相系统拍照保存。应用IPP分析软件测定切片中阳性蛋白区域的累积光密度值（IOD值）。

1.2.6 电镜样本制作及观察 取各感染组（12h和死亡鼠各1只）胸腺、心、肝、肺和肾组织各0.5cm×0.5cm×0.5cm，置入电镜固定液，经2.5%戊二醛和1%锇酸双重固定，丙酮酸梯度脱水，Epon-812环氧树脂包埋，RMC-PT超薄切片机切片，超薄切片经铅-铀双重染色，H-7500透射电镜下观察并拍片。

1.3 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，计量资料用表示。Fisher确切概率法分析死亡率，方差分析和LSD检验分析Fas和FasL蛋白的表达。

2 结果

2.1 死亡率比较 Mf和Mpi感染组小鼠均在感染3～5d后死亡 (100%)，非免疫抑制Mf感染组死亡2只(16.7%)，正常NS对照组及免疫抑制NS对照组均无小鼠死亡。Mf和Mpi感染组死亡率与其他3组比较，均有统计学差异（均P＜0.01）。

2.2 血清再培养结果 NS对照组未见支原体菌落，各感染组支原体分离培养均见“油煎蛋”样阳性菌落，为Mf或Mpi再培养阳性。

2.3 Fas/FasL蛋白免疫组化检测 Mf感染组Fas蛋白IOD值77 082.40±12 093.40，Mpi感染组为10 5462.95± 23 525.31，较非免疫抑制感染组21 006.39±9 372.51及对照组13 583.04±4756.39明显升高，均有统计学差异（均P＜0.01）。而Mf或Mpi感染组FasL蛋白IOD值也明显升高，分别是92 191.71±8 322.01及115 523.42±26 150.27，与非免疫抑制感染组47 013.15±12 332.40及对照组9 965.25±4 723.46比较，也具有统计学差异（均P＜0.01）。Mf和Mpi感染组和对照组Fas/FasL表达（图1，见插页）。

2.4 超微结构观察 感染组小鼠心、肝、肺和肾等多器官广泛损伤，感染12h后胸腺组织细胞已发生超微结构改变，至死亡时胸腺细胞胞核严重固缩，内质网空泡化。感染组细胞Fas和FasL的阳性表达显著升高提示凋亡加速。并且，胸腺细胞Fas/FasL高表达与胸腺、心、肺、肝和肾等多器官炎症、坏死损伤相一致（图2，见插页）。

3 讨论

Fas广泛表达于胸腺、肺等组织细胞表面，与其相应配体FasL共同介导细胞凋亡。有实验提示机体在感染、炎症过程中，免疫细胞表达FasL与细胞表面的Fas结合促使细胞凋亡，而细胞凋亡的同时伴随着细胞的炎症与坏死[6]。研究证实，从AIDS患者Kaposi’s Sarcoma中或Mf感染致死的患者中分离的Mf均含有HIV-1的基因片段，此基因片段或许增加Mf的致病性[3]。Nicolson等[3]推测致病性发酵支原体也能像HIV一样直接侵入免疫系统攻击靶细胞（免疫细胞），并在细胞内快速增殖，致重要器官（心、肝、肺、肾和脑）组织细胞坏死，导致患者迅速死亡，以上与我们的动物实验结果完全一致。Lo[7]报道发酵支原体感染猴子后抑制正常的炎症免疫反应，使抗体反应缺如或产生缓慢，随之演变为各器官损伤，持续放大和自我破坏的炎症过程，导致播散性炎症细胞的活化，最终表现为致命的全身系统性感染，严重时是暴发性的。MODS是全身性炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）进行性加重的结果，其最终后果是不可逆转而快速致死[8-9]。

本实验中免疫抑制小鼠在感染Mf或Mpi的3～5d内死亡率100%，与非免疫抑制Mf感染对照组（2/12，16.7%）比较有统计学差异。电镜下提示感染死亡小鼠的胸腺、心、肝、肺、肾等重要器官组织细胞坏死、空泡化，细胞中见3层膜结构的支原体颗粒。尤其是免疫抑制Mpi感染组12h胸腺组织见炎性细胞浸润，细胞核固缩、变形，线粒体肿大、空泡化等超微结构改变。结果与Lo[7]报道的猴子体内实验相一致，尤其是感染小鼠胸腺细胞Fas/FasL高表达与多器官损伤一致。此实验结果为发酵支原体和梨支原体在免疫抑制患者体内致病性研究提供了一定的实验依据。

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2012-08-14）

（本文编辑：胥昀）

温州市科技计划项目（Y20110107）

325000 温州医学院附属第一医院实验诊断中心（温秀姝）；温州医学院检验医学院生命科学学院（周丽萍、沈丹丹）

周丽萍，E-mail：zlpzlp19491949@163.com

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate expression of Fas/FasL in thymocytes and its relation with multiple organ damage in mice lethally infected by Mycoplasma fermentans(Mf)and Mycoplasma pirum(Mpi).Methods 55 ICR mice were randomly divided into experimental group (immunosuppression+Mf and Mpi infection,n=24)and control groups(non-immunosuppression+Mf infection,and normal group,n=31).Mice in experiment group were injected intraperitoneally with 0.3ml(6×108-9/ml)Mf or Mpi,the NS group was injected with 0.3ml sterile normal saline.The mortality rate was evaluated and serum samples were taken for cultivation of the mycoplasma.The expression of Fas/FasL in mice thymus was analyzed with immunohistochemistry.The ultrastructural changes of thymus,heart,lung,liver and kidney were observed with electron microscopy.Results The mice in experimental group all died (24/24)within 3-5 days after infection.The expression of Fas/FasL in thymocytes was high,which was consistent with the extent of damage in the heart,liver,lung and kidney. Conclusion The high expression of Fas/FasL in thymocytes is correlated with the multi-organ damage in Mf and Mpi infected mice.