胃癌组织中TIMP-3基因甲基化水平及临床意义研究

余江流 凌志强 韩静 吕萍 余齐鸣 郑智国 赵挺 王建军

胃癌组织中TIMP-3基因甲基化水平及临床意义研究

余江流 凌志强 韩静 吕萍 余齐鸣 郑智国 赵挺 王建军

目的 探讨胃癌患者癌组织中组织金属蛋白酶抑制因子-3（TIMP-3）基因启动子CpG岛甲基化与胃癌侵袭转移能力及预后的相关性。 方法 运用甲基化特异性实时荧光定量聚合酶链反应（qMSP）技术检测92例胃癌患者癌组织、癌旁组织和40例正常人胃组织、48例胃炎患者胃组织中TIMP-3基因启动子CpG岛甲基化状态,分析TIMP-3基因异常甲基化与胃癌患者临床病理特征及预后之间的关系。 结果 92例胃癌患者癌组织中,58例（63.0%）检测到TIMP-3基因甲基化,配对的癌旁组织中只有4例（4.4%）存在TIMP-3基因甲基化，正常人胃组织和胃炎组织中均没有TIMP-3基因甲基化。TIMP-3基因甲基化与肿瘤大小、生长类型、分化程度、静脉侵犯、浸润深度、淋巴结转移和临床分期间均存在相关性（均P＜0.05），而与患者性别、年龄、Hp感染状况以及肿瘤着生部位等无关（均P＞0.05）。生存分析表明TIMP-3基因非甲基化胃癌患者具有独立的生存优势（P＜0.01）。 结论 胃癌患者TIMP-3基因甲基化增强肿瘤的侵袭能力，甲基化水平和肿瘤恶性程度正相关，TIMP-3基因高甲基化提示胃癌患者不良预后。

胃肿瘤 TIMP-3基因 甲基化 临床意义

Gastric neoplasms Tissue inhibitor of metalloproteinase 3 gene Methylation Clinical significance

胃癌是世界高发的恶性肿瘤，发病率和致死率均处于各大恶性肿瘤前列，并且一直处于上升趋势[1-2]。最近研究表明以DNA甲基化为主要调控方式的表观遗传调控在胃癌的发生、发展中发挥着重要作用[3]。基质金属蛋白酶抑制剂（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP-3）基因是位于22号染色体q13.1位置的抑癌基因，其表达产物TIMP-3蛋白是基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMP）抑制剂，具有抑制上皮细胞转移、抑制肿瘤血管生成、抑制细胞增殖及促进细胞分化和凋亡的功能[4-8]。最新有研究报道，在各种肿瘤中均存在TIMP-3基因甲基化失活现象，可影响患者的治疗效果和预后[9-12]。本研究采用甲基化特异性实时荧光定量PCR（quantitative methylation-specific real-time PCR，real-time MSP）技术对胃癌组织和胃炎以及正常胃组织TIMP-3基因启动子CpG岛甲基化水平进行检测,并探讨其临床意义及在预后评价中的作用。

1 材料和方法

1.1 材料 组织样本收集于浙江省肿瘤医院、浙江省人民医院和杭州市淳安县第一人民医院，其中包括2008-1—2009-12病理确诊的92例原发性胃腺癌患者癌组织（男53例，女39例，平均年龄53.8周岁）、癌旁组织和年龄性别匹配的正常胃黏膜组织（正常志愿者胃镜取得）40例（男24例，女16例；平均年龄51.5周岁）、胃炎组织48例（男30例，女18例，平均年龄64.2周岁）。病例均经术前内镜活检病理诊断,术后组织标本均经石蜡切片病理确诊。所有患者术前均未行放疗和化疗，临床病理资料见表1。本研究经浙江省肿瘤医院、浙江省人民医院和杭州市淳安县第一人民医院伦理委员会批准同意，患者均签署知情同意书。

表1 胃癌患者临床病理特征与TIMP-3基因甲基化关系（例）

全部患者由本研究组随访负责人专门跟踪随访,具有完整的随访资料,均自手术日起计生存和随访时间,至患者死亡或随访截止到2011-06。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA提取 将所取组织切成5μm的切片，置于载玻片上37℃干燥过夜。经脱石蜡处理后，HE染色，用27G针挑选约5 000个肿瘤细胞核，然后在42℃下用40μl 200μg/ml的蛋白酶K（Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,MO）处理72h。用苯酚、氯仿、异戊醇和乙醇沉淀法提纯DNA，用紫外分光光度计（Nano Drop，ND-1 000）检测A260/A280值评价DNA质量。

1.2.2 亚硫酸氢盐处理 DNA样本按EpiTect Bisulfite（Qiagen公司）使用说明书操作。10 μg基因组DNA内加入5μl浓度为3mol/L的NaOH裂解液，37℃变性20min后加入2mol/L亚硫酸氢钠（pH5.0）520μl和0.2 mol/L的氢醌30μl，50℃水浴16～18h，于1ml DNA纯化树脂中加入DNA样品及8%异丙醇2ml滤析，3mol/L的醋酸钠与100%乙醇沉淀，离心弃上清液，自然干燥，加20μl TE溶液溶解,采用全基因组扩增技术对亚硫酸氢盐修饰DNA进行扩增，-20℃保存。

1.2.3 qMSP分析 甲基化和非甲基化的TIMP-3基因引物由Invitrogen公司合成，序列见表2。在ABI 7 500 PCR仪（ABI system,美国）上对亚硫酸氢钠法修饰的DNA模版进行qMSP分析,按SYBR Premix Taq ExTaq Kit（TaKaRa公司）说明书进行。各样品分别使用甲基化、非甲基化引物进行定量分析,用体外经SssI甲基转移酶处理的人类基因组DNA（NEB公司）作为阳性对照、未处理的正常人外周血DNA作为阴性对照,蒸馏水代替模板作为空白对照。根据所测CT值通过标准曲线计算在各样品DNA中甲基化的拷贝数和非甲基化拷贝数。甲基化百分率计算公式如下：甲基化百分率M%=甲基化DNA拷贝数/（靶基因总拷贝数）×100%（甲基化DNA拷贝数和非甲基化DNA拷贝数的总和记作靶基因总拷贝数）。按甲基化水平分为0～4共5个等级，M%＜20.0%为0分，评为0级，20.0%≤M%＜40.0%为1分，评为1级，40.0%≤M%＜60.0%为2分，评为2级，60.0%≤M%＜80.0%为3分，评为3级，M%≥80.0%为4分，评为4级。PCR反应结束后由熔解曲线及扩增曲线判定扩增结果。

1.3 统计学处理 应用SPSS18.0统计软件,各组间率的差异比较采用χ2检验或Fisher确切概率法,单因素生存分析以及生存曲线绘制采用Kaplan-Meier法，Log-Rank检验进行生存比较。用Cox比例风险回归模型进行多因素生存分析,显著性检验采用Wald检验。

表2 TIMP-3基因甲基化和非甲基化引物序列

2 结果

2.1 胃癌患者癌组织及癌旁组织、正常人和胃炎患者胃组织TIMP-3基因甲基化水平 40例正常胃黏膜组织和48例胃炎组织均未检测到TIMP-3基因启动子CpG岛甲基化。92例胃癌患者癌组织中，TIMP-3基因启动子CpG岛异常甲基化占63.0%（58/92），未甲基化37.0%（34/92）。癌旁组织中，只有4.4%（4/92）的患者检测到TIMP-3基因启动子CpG岛异常甲基化，并且甲基化水平均为1级，即甲基化率＜40%，如图1。胃癌组织TIMP-3基因启动子CpG岛甲基化比例显著高于癌旁组织（63.0%vs4.4%，P＜0.01）。

图1 胃癌患者癌组织（A）和癌旁组织（B）TIMP-3基因甲基化水平

2.2 胃癌患者TIMP-3基因甲基化与临床病理特征的关系 胃癌患者的TIMP-3甲基化状态与临床病理特征的关系分析表明，肿瘤＞5cm的甲基化水平高于肿瘤＜5cm的；肿瘤浸润型生长的甲基化水平高于膨胀性生长；低分化肿瘤的甲基化水平高于高中分化；淋巴管侵犯阳性、静脉侵犯阳性、淋巴结有转移的患者甲基化水平高于阴性患者；T3、T4期患者甲基化水平高于T1、T2期患者；临床分期Ⅲ/Ⅳ期患者甲基化水平高于Ⅰ/Ⅱ期（均P＜0.05）。而TIMP-3基因甲基化水平与患者年龄、性别、是否Hp感染、是否存在远处转移和肿瘤位置间没有相关性（P＞0.05），见表1。

2.3 TIMP-3基因高甲基化预示胃癌患者不良预后Kaplan-Meier单因素分析结果表明TIMP-3基因甲基化影响胃癌患者的预后。根据甲基化分数将胃癌患者分为低甲基化组（0分）、中甲基化组（1～3分）和高甲基化组（4分），低甲基化组胃癌患者在最长随访42个月内所有病例均未出现复发，而中甲基化组和高甲基化组分别在随访19个月和15个月时出现首例进展病例。TIMP-3基因甲基化患者术后生存状况较非甲基化患者差,见图2。Cox回归模型分析表明TIMP-3基因甲基化是胃癌患者预后的独立影响因子（P=0.01，RR=2.203，95%CI:1.21～4.01）。

图2 胃癌患者TIMP-3基因甲基化与无进展生存期的关系

3 讨论

TIMP-3蛋白是内源性的基质金属蛋白酶抑制因子，参与正常细胞的生物学行为，在肿瘤的发展中也发挥着重要作用，有研究报道[13-16]在胃癌、乳腺癌和食管癌等肿瘤中TIMP-3基因甲基化导致表达下调，从而影响患者的治疗敏感性和预后。本研究发现63.0%的胃癌患者癌组织存在不同程度的TIMP-3基因启动子CpG岛甲基化，只有4.4%的配对癌旁组织中检测到TIMP-3基因甲基化。而在正常胃黏膜和胃炎患者组织中均未检测到，这表明TIMP-3基因的甲基化和胃癌有明显的相关性。胃癌患者癌组织TIMP-3甲基化程度显著高于癌旁组织，因此组织TIMP-3基因的检测可以用于术前评价，作为手术切除范围的一个参考指标。

TIMP-3基因甲基化水平与患者临床病理特征关系的分析表明瘤体越大，分化程度越低及分期越晚的患者癌组织TIMP-3基因甲基化概率越大，这与Cruz-Munoz等[10]研究结果一致。从肿瘤生长类型来看，浸润型生长的肿瘤TINP-3基因甲基化水平明显高于膨胀型。大量研究报道[17-20]TIMP-3能够影响细胞的侵袭能力，而TIMP-3基因甲基化提高了食管癌、肺癌以及乳腺癌等肿瘤细胞的侵袭能力。本研究表明浸润深度越深，存在静脉侵犯或（和）淋巴管侵犯及淋巴结转移的患者癌组织TIMP-3基因甲基化程度较高。而在是否存在远处转移的患者间没有观察到TIMP-3基因甲基化水平的差异，可能是因为样本量较小，有待增加样本量进一步研究。与Smith等[16]在食管癌中的研究结果一样，本研究提示胃癌中TIMP-3基因甲基化水平不受患者年龄、性别及部位影响，胃体、胃窦和贲门肿瘤均存在较高水平的TIMP-3基因甲基化。此外，Hp感染也不会影响TIMP-3基因的甲基化状态。

本研究进一步分析了TIMP-3基因甲基化对胃癌患者预后生存的影响，结果表明癌组织TIMP-3基因甲基化是胃癌患者预后的独立影响因子。随着TIMP-3基因甲基化水平的升高，胃癌患者术后无进展生存时间显著下降，这与Gu等[21]研究结果相一致，TIMP-3基因甲基化在其他肿瘤中同样显著降低患者的生存时间。Mohammad等[22]研究报道TIMP-3甲基化与膀胱癌患者分期和肿瘤进展相关，显著降低术后生存时间；Darnton等[18]报道食管癌中甲基化引起的TIMP-3基因表达下调提示不良预后。

总之，TIMP-3基因甲基化是胃癌中的高频事件。TIMP-3基因甲基化程度随胃癌进展逐渐增加，导致TIMP-3表达下调，增强了肿瘤细胞的侵袭能力，从而影响患者的治疗效果和预后。对胃癌组织TIMP-3基因启动子CpG岛甲基化水平的检测可以应用于肿瘤的分期分型以及恶性程度评估，TIMP-3基因甲基化水平可以作为胃癌预后评价因子。

[1]Jemal A,Siegel R,Xu J,et al.Cancer statistics,2010[J].CA Cancer J Clin,2010,60(5):277-300.

[2]Jemal A,Bray F,Center M M,et al.Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin,2011,61(2):69-90.

[3]Hou L,Wang H,Sartori S,et al.Blood leukocyte DNA hypomethylation and gastric cancer risk in a high-risk Polish population[J].Int J Cancer,2010,127(8):1866-1874.

[4]Janssen A,Hoellenriegel J,Fogarasi M,et al.Abnormal vessel formation in the choroid of mice lacking tissue inhibitor of metalloprotease-3[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2008,49(7):2812-2822.

[5]Zerrouqi A,Pyrzynska B,Febbraio M,et al.P14ARF inhibits human glioblastoma-induced angiogenesis by upregulating the expression of TIMP3[J].Clin Invest,2012,122(4):1283-1295.

[6]Lee J K,Shin J H,Suh J,et al.Tissue inhibitor of metalloproteinases-3(TIMP-3)expression is increased during serum deprivation-induced neuronal apoptosis in vitro and in the G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis:a potential modulator of Fas-mediated apoptosis[J].Neurobiol Dis,2008,30(2): 174-185.

[7]Yang Y,Jalal F Y,Thompson J F,et al.Tissue inhibitor of metalloproteinases-3 mediates the death of immature oligodendrocytes via TNF-α/TACE in focal cerebral ischemia in mice[J].J Neuroinflammation,2011,8:108.

[8]Bernot D,Barruet E,Poggi M,et al.Down-regulation of tissue inhibitor of metalloproteinase-3(TIMP-3)expression is necessary for adipocyte differentiation[J].J Biol Chem,2010,285(9): 6508-6514.

[9]Mylona E,Magkou C,Giannopoulou I,et al.Expression of tissue inhibitor of matrix metalloproteinases(TIMP)-3 protein in invasive breast carcinoma:relation to tumor phenotype and clinical outcome[J].Breast Cancer Res,2006,8(5):R57.

[10]Cruz-Mu oz W,Kim I,Khokha R.TIMP-3 deficiency in the host, but not in the tumor,enhances tumor growth and angiogenesis [J].Oncogene,2006,25(4):650-655.

[11]Carvalho A L,Henrique R,Jeronimo C,et al.Detection of promoter hypermethylation in salivary rinses as a biomarker for head and neck squamous cell carcinoma surveillance[J].Clin Cancer Res,2011,17(14):4782-4789.

[12]Liu B L,Cheng J X,Zhang W,et al.Quantitative detection of multiple gene promoter hypermethylation in tumortissue, serum,and cerebrospinal fluid predicts prognosis of malignant gliomas[J].Neuro Oncol,2010,12(6):540-548.

[13]Peterson N B,Beeghly-Fadiel A,Gao Y T,et al.Polymorphisms in tissue inhibitors of metalloproteinases-2 and-3 and breast cancer susceptibility and survival[J].Int J Cancer,2009,125 (4):844-850.

[14]R hrs S,Dirks W G,Meyer C,et al.Hypomethylation and expression of BEX2,IGSF4 and TIMP3 indicative of MLL translocations in acute myeloid leukemia[J].Mol Cancer,2009,8:86.

[15]Waki T,Tamura G,Sato M,et al.Promoter methylation status of DAP-kinase and RUNX3 genes in neoplastic and non-neo-plastic gastric epithelia[J].Cancer Sci,2003,94(4):360-364.

[16]Smith E,De Young N J,Tian Z Q,et al.Methylation of TIMP3 in esophageal squamous cell carcinoma[J].World J Gastroenterol,2008,14(2):203-210.

[17]Castro M,Grau L,Puerta P,et al.Multiplexed methylation profiles of tumor suppressor genes and clinical outcome in lung cancer[J].J Transl Med,2010,8:86.

[18]Darnton S J,Hardie L J,Muc R S,et al.Tissue inhibitor of metalloproteinase-3(TIMP-3)gene is methylated in the development of esophageal adenocarcinoma:loss of expression correlates with poor prognosis[J].Int J Cancer,2005,115(3): 351-358.

[19]Johnson J L,Sala-Newby G B,Ismail Y,et al.Low tissue inhibitor of metalloproteinases 3 and high matrix metalloproteinase 14 levels defines a subpopulation of highly invasive foam-cell macrophages[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2008,28(9):1647-1653.

[20]Song B,Wang C,Liu J,et al.MicroRNA-21 regulates breast cancer invasion partly by targeting tissue inhibitor of metalloproteinase 3 expression[J].J Exp Clin Cancer Res,2010,29: 29.

[21]Gu P,Xing X,T nzer M,et al.Frequent loss of TIMP-3 expression in progression of esophageal and gastric adenocarcinomas[J].Neoplasia,2008,10(6):563-572.

[22]Hoque M O,Begum S,Brait M,et al.Tissue inhibitor of metalloproteinases-3 promoter methylation is an independent prognostic factor for bladder cancer[J].J Urol,2008,179(2):743-747.

2012-08-20）

（本文编辑：胥昀）

浙江省科技计划资助项目（2009C33143）；2011年省医药卫生平台骨干人才计划项目（2011RCA009）

325035 温州医学院检验医学院生命科学学院（余江流、凌志强、吕萍、韩静，余江流系硕士研究生，现在浙江省肿瘤医院实习，凌志强系温州医学院硕士生导师）；浙江省肿瘤研究所（凌志强、郑智国），浙江省肿瘤医院腹部肿瘤外科（余齐鸣）；浙江省人民医院普外科（赵挺）；杭州市淳安县第一人民医院普外科（王建军）

凌志强，E-mail:lingzq@hotmail.com

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the relationship of TIMP-3 gene CpG island methylation with the invasiveness and prognosis of gastric cancer. Methods Tissue samples were collected from 92 cases of gastric cancer patients,48 cases of gastritis and 40 healthy subjects.Methylation levels of the TIMP-3 gene promoter CpG islands were detected by methylation-specific real-time polymerase chain reaction(qMSP).The relationship of TIMP-3 gene ectopic methylation with invasiveness and prognosis for gastric cancer patients was analyzed. Results TIMP-3 gene methylation was detected in 63.0%of gastric cancer tissues and 4.4%of the paired pericancerous mucosa.TIMP-3 gene methylation was not detected in all samples from gastritis patients and normal controls.TIMP-3 gene methylation levels were correlated with tumor size,growth type,differentiation,lymphatic invasion,vein invasion,invasion depth,lymph node metastasis and clinical stage of gastric cancer(P＜0.05).On the contrary,there was no correlation of TIMP-3 gene methlylation with gender,age,Hp infection status,lesion site and distant metastasis(P＞0.05).Survival analysis showed that patients with non-methylated TIMP-3 gene had an independent survival advantage(P＜0.001). Conclusion TIMP-3 gene methylation is correlated with the degree of malignancy and poor prognosis of gastric cancer.