鼻咽癌组织中p15INK4b和p27KIP1基因甲基化及其相关性研究

王克义 倪海峰 沈俊娅 冷建杭 王建莉

●论 著

鼻咽癌组织中p15INK4b和p27KIP1基因甲基化及其相关性研究

王克义 倪海峰 沈俊娅 冷建杭 王建莉

目的 探讨鼻咽癌组织中p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化状态在鼻咽癌临床早期诊断和治疗中的作用。方法应用甲基化特异性PCR方法对65例鼻咽癌组织（鼻咽癌组）和30例正常鼻咽上皮组织（对照组）中的p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化状态进行检测。结果鼻咽癌组中p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化阳性率分别为26.2%（17/65）和61.5%（40/65），两者总检出率为72.3%（47/65）；而对照组中均未检测到p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化；两组间p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化阳性率的差异具有统计学意义（均P＜0.01）。鼻咽癌组中p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化与其临床分期及病理特征均无明显相关性（均P＞0.05）。同时，p15INK4b基因甲基化和p27KIP1基因甲基化间无明显相关性（r=-0.03，P＞0.05）。结论p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化可能参与鼻咽癌的发生、发展；p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化具有一定的肿瘤特异性，有助于鼻咽癌的早期辅助诊断和治疗。

鼻咽癌 p15INK4b基因 p27KIP1基因 甲基化

【 Abstract】 ObjectiveTo investigate the promoter methylation status of p15INK4band p27KIP1genes in nasopharyngeal carcinoma (NPC).MethodsThe methylation status of p15INK4band p27KIP1genes promoter region were detected by methylation-specific polymerase chain reaction (MSP)in 65 specimens of NPC tissues(NPC group)and 30 specimens of normal nasopharyngeal epithelia tissues(control group).ResultsThe promoter methylation rates of p15INK4band p27KIP1genes were 26.2% (17/65)and 61.5%(40/65),respectively in NPC group,while no methylation of the two genes were detected in control group(P＜0.01).The methylation of p15INK4band p27KIP1genes were not correlated with the clinicopathological characteristics of patients with NPC(P＞0.05).There were no significant correlation between the methylations of p15INK4bgenes and p27KIP1genes(r=-0.03,P＞0.05).ConclusionThe methylation of p15INK4band p27KIP1genes promoter regions may be associated with the development of NPC,which may used as potential markers for early diagnosis of NPC.

鼻咽癌是我国最常见的头颈部恶性肿瘤，恶性程度较高，且易转移。细胞周期调控异常与肿瘤的发生关系密切，p15INK4b和p27KIP1基因同属于细胞周期素依赖性激酶抑制因子家族成员，对细胞增殖周期起负调节作用。p15INK4b或p27KIP1基因失活，可使细胞增殖失控向肿瘤性增生转化，而在多种肿瘤中发现DNA异常甲基化是引起抑癌基因失活的重要机制之一。鼻咽癌的发生与多种抑癌基因的DNA甲基化有关，但对同一肿瘤，同时检测p15INK4b和p27KIP1基因甲基化的报道尚未见。本研究对鼻咽癌组织中的p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化状态进行检测，以探讨其在鼻咽癌发生、发展中的临床意义及其相互关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集2009-09—2012-09杭州市第一人民医院就诊的未经放化疗的65例鼻咽癌患者的纤维鼻咽镜活检标本，患者中男43例，女22例，年龄21～72（44.1±9.1）岁。病理诊断（参照1991年WHO分型）：低分化鳞癌56例，未分化癌9例。TNM分期（按照2002年UICC制定标准）：Ⅰ期6例，Ⅱ期20例，Ⅲ期26例，Ⅳ期13例。另择30例行鼻中隔矫正术患者的鼻腔后上段近鼻咽部正常上皮组织，患者中男19例，女11例，年龄20～73（45.0±8.5）岁。全部组织标本均经病理学检查确诊。两组患者性别、年龄的差异均无统计学意义（均P＞0.05）。另取1名健康青年外周血淋巴细胞作为阳性对照。本研究通过医院伦理委员会批准后进行，所有标本在采集前均与患者及志愿者签定知情同意书。

1.2 主要试剂 DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；甲基化酶试剂盒为新英格兰BioLabs公司产品；TakaRa Ex Taq耐热性DNA聚合酶、Marker为大连宝生物工程有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取 严格按试剂盒说明书进行，分别从鼻咽癌组织、正常鼻咽上皮组织及外周血淋巴细胞中提取基因组DNA。用分光光度仪测定OD260、OD280，计算浓度及OD260/OD280比值，OD260/OD280比值≥1.8的DNA为合格样本。

1.3.2 外周血DNA的CpG甲基化酶修饰 取1μgDNA、2μl10×反应缓冲液 、0.1μl 200×S-腺苷甲硫氨酸、1UCpG甲基化酶，加去离子水至20μl，37℃温育1h。

1.3.3 DNA亚硫酸氢盐修饰 将鼻咽癌组织、正常鼻咽上皮组织和外周血淋巴细胞中提取的DNA及经CpG甲基化酶处理的DNA分别作亚硫酸氢盐修饰，具体操作步骤参照Zhang等[1]报道的方法进行。外周血淋巴细胞中提取的DNA经亚硫酸氢盐修饰后用于非甲基化阳性对照模板。

1.3.4 甲基化特异性PCR p15INK4b基因甲基化和非甲基化特异性PCR引物序列参照Wong等[2]的报道，其中p27KIP1基因甲基化特异性 PCR引物序列：上游5′-ATGGAAGAGGCGAGTTAGCGT-3′，下游5′-AACGCCGCCGAACGACTCCCG-3′；p27KIP1基因非甲基化特异性PCR引物序列：上游5′-ATGGAAGAGGTGAGTTAGTG-3′，下游5′-AACACCACCAAACAACTCCCA-3′，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成。甲基化特异性PCR程序（片段大小197bp）：95℃预变性3min，94℃30s、60～65℃20s、72℃20s，共37个循环；最后72℃延伸5min。非甲基化特异性PCR程序（片段大小197bp）：95℃预变性3min，94℃30s、59～61℃20s、72℃20s，共37个循环；最后72℃延伸5min。2%琼脂糖凝胶电泳分析。正常外周血淋巴细胞DNA作为非甲基化阳性对照，CpG甲基化酶修饰后正常外周血淋巴细胞DNA模板作为甲基化阳性对照，去离子水作为空白对照。

1.4 判断标准 将仅用甲基化引物扩增有特异性扩增产物或用甲基化和非甲基化引物扩增均有特异性扩增产物的标本定义为阳性（甲基化）标本；仅有非甲基化引物特异性扩增产物的标本定义为阴性（非甲基化）标本。

1.5 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件，组间计数资料的比较采用χ2检验，p15INK4b和p27KIP1基因甲基化的相关性采用Spearman等级相关分析。

2 结果

2.1 两组患者p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化状态 p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化状态检测结果见图1。

图1 p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化状态检测结果（MSP：甲基化特异性PCR方法；M：甲基化特异性PCR；U：非甲基化特异性PCR；T1～4：鼻咽癌组织；N1～4：正常鼻咽上皮组织；PC：阳性对照；H2O：阴性对照；Marker：100～200bp）

鼻咽癌组患者p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化阳性率分别为26.2%（17/65）和61.5%（40/65），两者总检出率为72.3%（47/65），而正常对照组均未检测到p15INK4b和 p27KIP1基因启动子区甲基化，两组患者p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化阳性率的差异均有统计学意义（均P＜0.01）。

2.2 鼻咽癌患者p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化与临床特征的关系 见表1。

由表1可见，p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化与患者年龄、性别、T分期、N分期、TNM分期、病理类型等临床特征均无相关性。

2.3 鼻咽癌患者p15INK4b与p27KIP1基因启动子区甲基化的关系 见表2。

由表2可见，65例鼻咽癌组织中同时出现p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化为10例，同时出现非甲基化为18例，两者无明显相关关系（r=-0.03，P＞0.05）。

3 讨论

我国鼻咽癌的发病率居世界首位，南方发病率高于北方，尤其是广西、广东、湖南等省份，发病率可高达15/ 10万～30/10万。近年来，鼻咽癌在江浙一带逐渐成为常见的头颈部恶性肿瘤。由于鼻咽癌的发生部位隐蔽，早期往往无任何症状，大多数患者初诊时就发现颈部淋巴结转移，75%的患者在确诊时已是Ⅲ、Ⅳ期。鼻咽癌的治疗效果与临床分期密切相关，Ⅰ期患者在放疗之后，5年生存率可达到90%以上，而晚期患者的5年生存率仅8%～10%[3]。因此，研究鼻咽癌发生、发展的机制并且寻找早期诊断及判断预后的生物学标志物已成为重要的课题。

表1 鼻咽癌患者p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化与临床特征的关系[例（%）]

表2 鼻咽癌患者p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化的关系（例）

细胞周期是细胞重要的生命现象之一，肿瘤的发生与细胞周期的失调密切相关。细胞周期调控主要通过细胞周期素（Cyclin）、细胞周期素依赖蛋白激酶（CDKs）和细胞周期素依赖蛋白激酶抑制蛋白（CDKIs）对G1/S和G2/M关卡的调控作用完成。CDKIs在此过程中发挥了重要的作用，其可分为两类：INK4/ARF基因家族和CIP/KIP基因家族。INK4/ARF基因是继p53基因和RB基因等数十个抑癌基因之后发现的专职调控细胞周期的抑癌基因[4]，定位于9P21，横跨大约35kb的范围，编码3个重要的抑癌基因：p15INK4b、p16INK4a和p14ARF，其中p15INK4b基因的cDNA全长837bp，编码由137个氨基酸组成的分子量为15kD的蛋白质。p15INK4b通过与细胞周期素依赖蛋白激酶CDK4/CDK6结合，从而抑制CDK4和CDK6的活性，促进RB基因的产物RB蛋白与转录因子E2F结合，抑制基因转录而使细胞停滞在G1期，从而抑制细胞的分裂和增殖。CIP/KIP基因家族包括p27KIP1、p57KIP2和p21CIP1/WAF1/SDI，其中 p27KIP1基因是1994年Polyak等[5]发现的一类非常重要的调控细胞周期并抑制细胞分裂的多重肿瘤抑制基因，定位于12P13，cDNA长度为594bp，编码由198个氨基酸组成的分子量为27kD的蛋白质。正常情况下，p27KIP1在细胞周期的G0/G1期表达增高，当细胞进入S期时表达下降。它可以抑制细胞的DNA合成，阻止细胞从G1期进入S期。作为一个非特异性CDKs抑制因子，p27KIP1能与CyclinDCDK4、CyclinD-CDK6、CyclinE-CDK2、CyclinA-CDK2等复合物结合，抑制其活性，使细胞停滞于G1期。此外，p27KIP1还具有启动细胞凋亡的作用。因此，p15INK4b和p27KIP1均具有显著的细胞周期负调控作用，其失活都将引起细胞周期G1-S期的重要转换，驱动细胞周期的运行，使细胞增殖、分裂过快，从而促使肿瘤形成。

基因突变、缺失和启动子区甲基化都是基因失活的机制，其中基因启动子区甲基化可引起与细胞增殖和分化有关的基因表达异常，导致细胞恶变，最后形成肿瘤。近年来的研究表明，肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌和前列腺癌等都与DNA的甲基化有关[6]。而据报道，p15INK4b和p27KIP1基因甲基化在腮腺样囊性癌[7]、肺癌[4]、食管癌[8]和肝癌[9]等肿瘤的发生、发展中起重要作用。目前，关于鼻咽癌组织中p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化的研究很少，且两者同时在鼻咽癌组织中的甲基化状态及其相互关系的研究尚未见报道。

董洪松等[10]发现，鼻咽癌组织中p15和p27蛋白表达阳性率分别为65.1%和69.7%，而在非鼻咽癌组织中均100%表达，并且p15和p27蛋白在鼻咽癌组织中的表达与鼻咽癌临床分期、淋巴结转移、脑神经侵犯及治疗后5年生存率无关。本研究结果显示，p15INK4b和p27KIP1基因甲基化均只发生在鼻咽癌组织中，阳性率分别为26.2%（17/65）和61.5%（40/65），两者总检出率为72.3%（47/65），表明p15INK4b和p27KIP1基因甲基化具有一定的肿瘤特异性，而且与董洪松等的研究结果相似，其甲基化状态与临床分期及病理特征均无相关性，提示p15INK4b和p27KIP1基因甲基化可能在鼻咽癌早期即发生，并参与癌变的整个过程。因此，p15INK4b和p27KIP1基因甲基化检测结果有助于良、恶性鼻咽组织的鉴别，并有望成为鼻咽癌的早期诊断指标。本研究结果也与Kwong等[11]的结果一致，即鼻咽癌中p15INK4b基因17%的启动子区甲基化状态与患者临床特征均无明显相关性。本研究还发现，鼻咽癌患者p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化无明显相关性，提示这两个基因在鼻咽癌的发生、发展中各自发挥作用，协同作用并不明显。

综上所述，鼻咽癌组织中p15INK4b和p27KIP1基因启动子区甲基化与其临床特征虽无明显关系，但该过程可能在鼻咽细胞的癌变早期即已发生，并参与鼻咽癌的整个细胞增殖过程，在鼻咽癌的发生、发展中起着重要作用，故有望成为鼻咽癌的早期诊断指标。DNA甲基化是一个可逆过程，用去甲基化药物可以逆转肿瘤抑制基因的甲基化失活对细胞的恶性转化过程，逆转甲基化修饰可以重新激活因甲基化失活的肿瘤抑制基因[12]。此外，由于p15INK4b和p27KIP1基因产物具有抑制细胞恶性增殖的作用，因此用药物促使这些甲基化的基因重新激活表达，或可恢复其抑制鼻咽癌细胞恶性增殖的能力。因此，去甲基化药物可能具有潜在的基因治疗价值，值得进一步深入研究。

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（本文编辑：沈叔洪）

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本刊编辑部

Promoter methylation status of p15INK4band p27KIP1genes in nasopharyngeal carcinoma

Nasopharyngeal carcinoma p15INK4bp27KIP1Methylation

2013-03-05）

310058杭州，浙江大学免疫学研究所（王克义、王建莉，王克义系在职硕士研究生，现在杭州市第一人民医院中心实验室工作）；杭州市第一人民医院耳鼻咽喉科（倪海峰），中心实验室（沈俊娅、冷建杭）

王建莉，Email:jlwang@zju.edu.cn