检测EML4-ALK融合基因对肺腺癌患者的临床意义

金涛 朱理 赵琼 方维嘉 曾蕾 彭玲 王一青

检测EML4-ALK融合基因对肺腺癌患者的临床意义

金涛 朱理 赵琼 方维嘉 曾蕾 彭玲 王一青

目的 探讨检测EML4-ALK融合基因对肺腺癌患者的临床意义。 方法 收集2012年7至12月手术或活检肺腺癌组织标本37例，所有标本均经病理证实为腺癌，用RT-PCR方法检测EML4-ALK融合基因的表达，设计9种探针检测EML4-ALK融合基因最常见的9种类型，并随访阳性患者的治疗结果。结果 37例腺癌标本中，1例检出EML4-ALK融合基因表达阳性，并经测序法证实为1型变异，检出率2.70%。为女性患者，左上肺肿块，T1N0M0，行左肺上叶肺癌根治术，术后给予克唑替尼，随访6个月无复发。结论 使用RT-PCR结合测序是一种快速、简便、容易推广的EML4-ALK融合基因检测技术，可以在肺腺癌患者检测中推广使用。

EML4-ALK融合基因 荧光定量PCR 分子诊断 肺腺癌

近年来，非小细胞肺癌（NSCLC）治疗最大的进展就是靶向药物的出现，由于靶向药物价格昂贵，故针对靶向药物是否有效的检测显得尤为重要。最早的TKI（tyrosine-kinase inhibitor）抑制剂已经发展出了较为成熟的EGFR（epidermal growth factor receptor）检测方案。2012年8月，美国FDA批准新的靶向药物克唑替尼（crizotinib）上市，为提高药物疗效和减少医疗负担，NCCN也推荐对拟使用克唑替尼的患者进行靶位点棘皮动物微管结合样蛋白4（echinoderm microtubule associated protein-like 4，EML4）与问变淋巴瘤激酶（anaplas tie lymphoma kinase，ALK）融合基因（EML4-ALK）的检测。本研究用RT-PCR法连续检测了37例浙江省的肺腺癌患者肿瘤标本，并随访阳性患者的治疗效果，以期探讨检测EML4-ALK融合基因对肺腺癌患者的临床意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料 选择浙江省人民医院和浙江大学医学院附属第一医院心胸外科2012年7至12月手术切除或经胸穿刺活检，并经病理证实的肺腺癌组织标本37例，患者临床资料齐全，均为首次发现的胸部肿瘤，术前均未进行放疗、化疗和免疫治疗。其中男14例，女23例，平均（54.1±5.9）岁。

1.2 方法

1.2.1 标本处理 37例肺腺癌患者的肿瘤标本（活检或手术切除组织，术后病理证实为腺癌）用液氮速冻，-80℃冰箱保存。对其进行总RNA提取，利用聚合酶链反应（RT-PCR）方法检测其EML4-ALK融合基因各亚型的存在情况。利用组织RNA提取试剂盒（杭州宝赛生物技术有限公司）提取总RNA。提取RNA的质量通过琼脂糖凝胶电泳鉴定。超低温冰箱（美国Thermo公司）保存备用。

1.2.2 PCR反应体系配制 配制20μl PCR反应体系：Real Time PCR Master Mix[东洋纺（上海）生物科技有限公司生产]10μl，各亚型引物（F/R）各0.4μl、探针0.3μl，Enzyme Mix[逆转录酶ReverTra AceR和RNase Inhibitor的混合酶液，东洋纺（上海）生物有限科技公司] 0.15μl，模板RNA 2μl，最终Nuclease-free Water[未经DEPC处理，东洋纺（上海）生物科技有限公司]补足到20μl体系。

1.2.3 探针设计 根据EML4基因断裂点的不同，常见的EML4-ALK有9种亚型[1-3]。在NCBI数据库筛查相关序列数据，设计相关的引物和探针（见表1）。

1.2.4 RT-PCR反应程序 设置RT-PCR反应条件如下：（1）45℃25min；（2）95℃5min；（3）40个循环（95℃10s，58℃40s）；（4）收集荧光数据：95℃，1min；65℃，30s；95℃，30s。采用一步法检测（直接利用RNA作为模版，避免单独逆转录程序），避免繁琐更换PCR管过程造成污染，产生假阳性和假阴性的检测结果。

1.2.5 检测EML4-ALK融合基因的RNA表达 采用37例肺腺癌患者的活检组织，提取相关总RNA进行RT-PCR检测。1例标本存在EML4-ALK融合基因1型的表达（图1）。初步显示该标本中有EML4-ALK融合基因的存在。

图1 EML4-ALK融合基因1 mRNA表达图[注：粗线为内参（EIF2A基因），细线为EML4-ALK融合基因1]

表1 EML4-ALK各亚型相关引物及探针

1.2.6 EML4-ALK融合基因测序鉴定 RT-PCR检测是一种快速的、敏感的诊断ALK融合基因的方法，需要高纯度的mRNA，为了排除融合基因假阳性的存在，我们用Sanger测序法（ABI 3130测序仪），对其进一步测序鉴定。测序结果见图2。

2 结果

在受检的37例肺腺癌患者中，1例经RT-PCR检测，其EML4-ALK1表达阳性（EML4-exon13/ALK-exon19），并经测序法证实为变异1型。EML4-ALK融合基因的率为2.70%（1/37）。该EML4-ALK融合基因阳性患者为女性，36岁。无吸烟史，左上肺肿块，T1N0M0，行左肺上叶肺癌根治术。术后1个月开始行克唑替尼治疗，随访6个月无复发。K-Ras和EGFR（Exon18-21）检测结果均为阴性。

图2 EML4-ALK融合基因1型测序图（注：EML4-ALK融合基因1型，在EML4基因13号内含子处（即*）与ALK基因20外显子发生融合）

3 讨论

EML4是棘皮动物微管相关蛋白样蛋白质家族成员[4]，它包括一个N一端基本区，一个疏水的棘皮动物微管相关蛋白样蛋白域和WD重复区。ALK首先在间变性大细胞淋巴瘤中被发现，作为一个核磷蛋白的融合者，伴随一个t（2；5）染色体重排[5]。

EML4-ALK融合蛋白于2007年首次被发现，Soda等[6]在1例NSCLC患者的组织标本中首次发现EML4-ALK融合基因。EML4和ALK分别位于2p21和2p23，两者之间相隔约120 000 bp个碱基对。2号染色体短臂易位形成了EML4-ALK融合基因，即EML4不同程度地被截断，倒置后连接于保留酪氨酸激酶活性的截断ALK上，就形成了不同的EML4-ALK融合基因，并表达EML4-ALK融合蛋白[7-9]。根据EML4的截断部位及长短不同，EML4-ALK至少有十余种变异体，而EML4的三个结构区域均在EML4-ALK融合基因异常激活中起重要作用[7，10]。

最常见的变异位点为E13；A20（变异1）及E6a/b；A20（变异3 a/b），在NSCLC中分别占33%和29%[13]，新的变异体也偶见报道。除了与EML4基因相融合以外，ALK基因在肺癌中还存在和TGF，KIF5B和KLC1等基因相融合的现象[11-12]，本研究设计的9种变异体基本涵盖了EML4-ALK融合基因95%以上的变异体[1，3]。

总体上EML4-ALk融合基因在NSCLC中的检出率不高，文献报道大约在2.7%～6.7%[6，14-15]，其中存在种族差异，当然使用的检测方法不同也是检出率不同的重要原因之一。最初学者们认为，EML4-ALK属NSCLC所独有。但2009年，Lin等[16]在其他肿瘤中也发现了EML4-ALK，包括乳腺癌（5/209），结直肠癌（2/83），及NSCLC（12/106），但仍以NSCLC为最高。

最初的研究者们还认为EML4-ALK融合基因和EGFR和K-ras基因突变是排他出现的，但是Tiseo等[17]在2011年报道了1例同时具有EGFR突变和EML4-ALK突变的病例，该患者是1例48岁无吸烟史的高加索男性患者，使用EGFR-TKIs（厄洛替尼）治疗未有临床益处。

根据现有的临床研究EML4-ALK融合基因出现阳性的患者大多具有下列特点：轻度或无吸烟史，年龄相对较轻，病理类型多为腺癌[18]，因为EML4-ALK融合基因大多出现于肺腺癌患者，故本实验入选的标本全部为病理证实的腺癌标本。

在临床实践中已使用多种技术来检测EML4-ALK融合基因，包括PCR技术（polymerase chain reaction），免疫组化技术（immunohistochemistry，IHC），荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）等。但是，目前还没有标准方法来检测NSCLC中的EML4-ALK融合基因。

FISH法是目前比较推荐的方法，但是该方法价格昂贵，假阳性高，需要特殊设备，不能确定突变的具体类型。RT-PCR法，灵敏、快速、价格便宜、无需特殊设备，是一种大部分实验室均可以开展的EML4-ALK融合基因检测技术，如果结合阳性标本的测序验证，不仅可以排除假阳性，还可以获得具体突变的类型。它的缺点需要设计每种类型的引物探针，假阴性可能还是存在的。

本研究第一次在浙江省肺腺癌患者中使用RT-PCR法结合测序检测了EML4-ALK融合基因的表达。检出1例阳性，该标本出现在第15例患者，估计在浙江肺腺癌患者中，EML4-ALK融合基因的检出率为2.7%～5.3%（2/38），这个比例与文献报道的基本一致。

我们的研究表明，使用RT-PCR结合测序是一种快速、简便、容易推广的EML4-ALK融合基因检测技术，可以在NSCLC标本检测中推广使用。

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Detection of EML4-ALK fusion gene in patient with lung adenocarcinoma

EML4-ALK RT-PCR Molecular diagnosis Lung carcinoma

2013-02-05）

（本文编辑：田云鹏）

浙江省科技厅项目资助（2012C13014-2）

310014 杭州，浙江省人民医院心胸外科（金涛、朱理）；浙江大学医学院附属第一医院心胸外科（赵琼、方维嘉、曾蕾、彭玲）；浙江大学医学院（王一青）

【 Abstract】Objective To detect echinoderm microtubule-associated protein-like 4 (EML4)-anaplastic lymphoma kinase(ALK)fusion gene in patients with non-small cell lung cancer(NSCLC).Methods Biopsy or surgical specimens were collected from 37 patients with pathologically confirmed adenocarcinoma from July 2012 to Dec 2012.The expression of ELM4-ALK fusion gene was detected by RT-PCR with primers designed for 9 subtypes of the fusion gene,and the detected gene was verified by sequencing. Results The expression of ELM4-ALK fusion gene was detected and verified in the surgical specimen from a 36y female patient with T1N0M0lung adenocarcinoma with a detection rate of 2.70%.The radical resection of upper lobe of the left lung was performed and XALKORI was given one month after the surgery.No metastasis was found after 6-months follow-up. Conclusion The detection rate for ELM4-ALK fusion gene is similar as reported in patients with lung adenocarcinoma, and the RT-PCR combined with sequencing is a sensitive and effective method for detection of EML4-ALK fusion gene in surgical or biopsy specimens of patients with lung adenocarninoma.