水蛭的高效液相指纹图谱研究

徐佳 杨瑶珺 刘晓帆 吴立洁 刘杰 戴待

2010版《中华人民共和国药典(一部)》规定水蛭为水蛭科动物蚂蟥WhitmaniapigraWhitman、水蛭HirudonipponicaWhitman或柳叶蚂蟥WhitmaniaacranulataWhitman的干燥全体，具有破血通经、逐瘀消癥的功效，用于治疗癥瘕痞块、中风偏瘫、跌扑损伤等症[1]。近年来，水蛭市场需求量增大，药材质量良莠不齐，严重影响其制剂的临床疗效，因此笔者采用主流品种蚂蟥药材进行指纹图谱研究。

中药成分复杂，单纯测定少数几种有效成分或指标成分难以控制其质量，因此指纹图谱的建立能全面反映整体成分的特征，更好的评价药材质量[2]。近年来，指纹图谱技术有了飞速的发展，逐渐成为建立中药材质量标准的的主流手段，在中药鉴定领域广泛应用。例如，在鉴定进口药物与国产药物上面的应用[3]，在研究相同类别化合物在不同中药的成分表达的异同[4]，在药材真伪鉴定方面[5]等。

但在动物类中药的指纹图谱方面，文献报道较少，本实验将指纹图谱技术引入到动物类中药材鉴定中，一方面可以解决水蛭药材常规鉴定客观数据缺失的弊端，另一方面由于水蛭等动物药材的有效成分研究并不全面且成果并未得到广泛的认可，而指纹图谱则可以宏观判别水蛭的质量，因此可以作为评价水蛭质量数据之一。

1 材料

1.1 仪器

Sigma 3K15离心机(希格玛公司)，Sartorious BP110S 分析天平(北京赛多利斯仪器有限公司)，DFT-100 手提式高速中药粉碎机(温岭市大德中药机械有限公司)，高效液相色谱仪Aglient 1100(美国安捷伦公司),DAD二极管阵列检测器(美国安捷伦公司)。

1.2 试剂

色谱甲醇( Fisher LOT126273)氯化钠(批号：20090706，北京化工厂)，磷酸二氢钾(批号：20111221，国药集团化学试剂有限公司)，次黄嘌呤(批号：069-110811，上海宝莱生物制品公司)，黄嘌呤对照品(批号：140662-200802，中国食品药品检定研究院)。

1.3 样品

经北京中医药大学中药学院杨瑶珺教授鉴定为水蛭科动物蚂蟥WhitmaniapigraWhitman，10批水蛭药材见表1。

表1 水蛭样品收集表

2 方法

2.1 色谱条件

Agilent TC-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相 0.01 mol/L磷酸二氢钾(A)-甲醇(B)，梯度洗脱：0～40分钟，A-B(95:5～90:10)；40～70分钟，A-B(90:10～50:50)；检测波长254 nm，流速0.8 ml/min，柱温25 ℃，进样量20 μl。

2.2 色谱条件的选择

提取方法考察：对比70%乙醇提取，超声提取，采用生理盐水浸提的方式，可以保留水蛭中的多种化学成分，使得指纹图谱更加全面、有效。

流动相的确定:(1)甲醇—水梯度洗脱；(2)甲醇—冰醋酸水溶液梯度洗脱；(3)乙腈—冰醋酸水溶液梯度洗脱；(4)甲醇—磷酸二氢钾梯度洗脱。通过选择多种流动相系统比较试验，以甲醇—磷酸二氢钾盐溶液为流动相，分离效果较好、各峰分离度较大、基线平稳、保留时间适中。

检测波长的选择：采用二极管阵列检测器，考察230 nm、240 nm、254 nm、280 nm等波长下的检测情况，结果表明提取液在254 nm下指纹图谱色谱峰数目适中，且色谱峰的信噪比大，基线平稳，故检测波长定为254 nm[6]。

参照物的选择：次黄嘌呤是水蛭含量测定的对照品，具有舒张支气管、平喘、扩张血管、降压等作用[7]，广泛存在于动物体内，和水蛭的药理作用有一定的关联性。本实验的对照品在文献中次黄嘌呤的基础上，引入黄嘌呤，在指认方面，完善水蛭的指纹图谱。

2.3 供试品溶液制备

取水蛭粗粉约1.25 g，置于10 ml离心管中，加生理盐水5 ml，摇匀，浸提24小时后离心10分钟(转速3500 r/min)。上清液过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得。

2.4 对照品溶液配制

精密称取次黄嘌呤2.52 mg，黄嘌呤2.56 mg，置于10 ml容量瓶中，以甲醇(色谱纯)溶液溶解并稀释，摇匀，制成每1 ml含次黄嘌呤0.252 mg，黄嘌呤0.256 mg的混标溶液。

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度考察 精密吸取5号供试品溶液，进样量20 μl，连续进样5次，测定指纹图谱。以峰面积的大小选取十强峰(十强峰总面积大于总峰面积的65%)，经计算，十强峰的相对保留时间的RSD值为0.05%～0.17%，相对峰面积的RSD值为0.3%～2.77%，RSD均小于3.0%，仪器的精密度良好。

2.5.2 重复性考察 取5号供试品溶液，进样量为20 μl，测定指纹图谱。经计算，十强峰的相对保留时间的RSD值为0.88%～2.57%，峰面积RSD为0.34%～2.84%，RSD值均小于3.0%，该方法的重复性良好。

2.5.3 稳定性考察 取5号供试品溶液，进样量为20 μl，分别在2、4、6、8、12、24小时测定指纹图谱，经计算，十强峰的相对保留时间的RSD为0.37%～1.67%，相对保留面积的RSD为0.24%～1.33%，RSD值均小于3.0%，该方法的稳定性良好。

表2 水蛭共有峰相对保留时间及相对峰面积

3 实验结果

3.1 指纹图谱及共有峰的标定

用建立的色谱条件，对10批样品进行测定,得到水蛭高效液相指纹图谱，见图2。水蛭所含成分的色谱峰在70分钟之内洗脱完全,有10个共有峰，对次黄嘌呤、黄嘌呤进行归属，并生成对照指纹图谱，见图3。

比较分析10批样品的色谱图，并计算各色谱峰的相对保留时间与相对峰面积，结果见表2。

图1 次黄嘌呤、黄嘌呤对照品色谱图

时间(min)图3 水蛭对照指纹图谱

S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10对照S110 9520 9360 9540 9500 9230 9540 9400 6500 9450 960S20 95210 9610 9670 9770 9570 9860 9850 6500 9850 987S30 9360 96110 9620 9710 9650 9720 9750 6350 9760 982S40 9540 9670 96210 9730 9630 9810 9640 6320 9670 984S50 9500 9770 9710 97310 9710 9900 9810 6460 9830 992S60 9230 9570 9650 9630 97110 9680 9720 6270 9740 983S70 9540 9860 9720 9810 9900 96810 9850 6490 9870 994S80 9400 9850 9750 9640 9810 9720 98510 6420 9990 991S90 6500 6500 6350 6320 6460 6270 6490 64210 6430 669S100 9450 9850 9760 9670 9830 9740 9870 9990 64310 993对照0 9600 9870 9820 9840 9920 9830 9940 9910 6690 9931

由上表得知，水蛭药材10个共有峰的的相对保留时间的RSD值在0.06%～1.31%，符合指纹图谱研究技术要求。但各自的相对峰面积差别很大，说明不同样品的相同成分含量相差悬殊。

3.2 相似度评价

利用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A》，对10样本指纹图谱进行匹配，相似度在0.669～0.994之间(见表3)。9号样品与对照指纹图谱的相似度为0.669，明显低于其他饮片的相似度。由1号至6号样品可以看出，水蛭在原药材阶段相似度差异不大，但是将其切段炮制成饮片后，相似度差异较大，因此不同的炮制方法会直接影响水蛭饮片的化学成分的种类与含量[8]。

4 总结与讨论

从水蛭的指纹图谱可以看出，该方法的重复性较好，不同水蛭药材的指纹图谱相似性较高，说明不同产地水蛭含有的化学成分大致相当。但是10个共有峰的相对峰面积RSD值很大，说明水蛭的共有成分含量差异很大，这可能与养殖方法、养殖环境、炮制有关。

由对照色谱可以看出，次黄嘌呤的峰面积很大，其对相似度的影响也较大，因此后续应继续改进提取方法与色谱条件，以平衡各色谱峰的峰面积，使数据更加具说服力。经过对10批不同产地的水蛭药材进行指纹图谱试验，表明所建立的检测方法操作简便、重现性好，为控制水蛭药材的质量提供了实验数据基础。

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)[S]. 北京：中国医药科技出版社，2010:77.

[2] 王喜军,曹玲,孙晖. 人工规范化种植防风药材的指纹图谱研究[J]. 世界科学技术-中医药现代化,2004,6(3):33-36.

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[4] Gulnur Toker ,Mustafa Aslan,Erdem Yesilada et al . Comparative evaluation of the flavonoid content in officinal Tiliae flos and Turkish lime species for quality assessment[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2001,26:111-121.

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[8] 张永太. 水蛭饮片次黄嘌呤含量测定[J]. 中成药,2008,30(8):1175-1177.