反相高效液相色谱法测定替硝唑氯化钠注射液中乙二胺四乙酸二钠含量

陆 滢

(江苏省盐城市第一人民医院，江苏 盐城 224000)

替硝唑氯化钠注射液对大多数厌氧菌有较强抗菌作用，临床用于各种厌氧菌感染，如败血症、骨髓炎、腹腔感染、盆腔感染、肺支气管感染。但在临床使用时，替硝唑氯化钠注射液有时会出现浑浊现象。有研究表明，替硝唑氯化钠注射液处方中添加乙二胺四乙酸二钠(EDTA)后可显著提高输液的稳定性，其原理为EDTA与输液中微量的金属离子形成螯合物后，阻止了金属离子对药物自身氧化的催化作用。因此在替硝唑氯化钠注射液处方中添加一定量的EDTA作为螯合剂，可显著改善输液的配伍稳定性。但如人体大量摄入EDTA，它会与血液及骨骼中经过的钙形成水溶性螯合物，被排除体外，引起低血钙或骨钙流失，因此有必要对EDTA的含量进行控制，虽然已有EDTA的检测报道，但所用方法不能定量检测。为确保用药安全，笔者参照相关文献建立了替硝唑氯化钠注射液中EDTA的含量测定方法。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪，Agilent-1200型色谱工作站(美国Agilent公司);BP211D型电子天平(德国赛多利斯公司);Seven Easy pH计(上海精密仪器科学仪器有限公司)。替硝唑氯化钠注射液(山东鲁抗辰欣药业有限公司，批号分别为 1121007，1120527，1120102，规格为 100 mL∶替硝唑 0．4 g与氯化钠 0．9 g);乙腈(美国Tedia公司)为色谱纯，乙二胺四乙钠二钠磷酸、10%四丁基氢氧化铵溶液，均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱:Agilent C18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm);流动相:乙腈-缓冲液(10%四丁基氢氧化铵溶液6 mL，加水稀释至200 mL，以磷酸调节pH至6．5)-水(20∶20∶60);检测波长:254 nm;流速:1．0 mL/min，柱温:30 ℃;进样量:20 μL。

2．2 溶液制备

精密称取EDTA适量，加水使溶解并定量稀释成0．5 g/L的EDTA溶液，精密吸取5 mL置50 mL容量瓶中，加1%硫酸铜溶液10 mL，加水稀释至刻度，摇匀，以0．45 μm的微孔滤膜滤过，即得对照品溶液。精密量取替硝唑氯化钠注射液适量(相当于EDTA 2．5 mg)，置50 mL容量瓶中，加水适量使溶解，加1%硫酸铜溶液10 mL，加水稀释至刻度，摇匀，以0．45 μm的微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。精密称取不含EDTA的空白制剂适量(相当于EDTA 2．5 mg)，置50 mL容量瓶中，加水适量使溶解，加1%硫酸铜溶液10 mL，加水稀释至刻度，摇匀，以0．45 μm的微孔滤膜滤过，即得空白对照溶液。

2．3 方法学考察

系统适用性试验:精密称取EDTA空白对照溶液、供试品溶液及对照品溶液各20 μL，分别注入高效液相色谱仪，记录色谱图，结果表明，EDTA峰的理论板数约为2 000，奥美拉唑钠与EDTA的分离度良好，见图1。

线性关系考察:精密吸取 0．5 g/L 的 EDTA 溶液 0．5，1．0，2．0，4．0，8．0，16．0 mL 分别置 50 mL 容量瓶中，加 1%硫酸铜溶液10 mL，用水稀释至刻度，摇匀，0．45 μm微孔滤膜滤过，分别精密量取续滤液20 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图以EDTA进样量(X)为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程 Y=53 653．764 5 X-1 486．165 8，r=0．999 8。结果表明，EDTA进样量在0．1～2．0 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

图1 高效液相色谱图

稳定性试验:取同一批(批号为1121007)的供试品溶液，精密吸取20 μL，每间隔一定时间进样，测定，以峰面积考察。结果的 RSD为0．93%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。

精密度试验:取同一批(批号为1121007)替硝唑氯化钠注射液6份，依法平行测定其含量，结果EDTA的平均含量为每瓶4．43 mg，RSD为1．45%，表明仪器精密度良好。

加样回收试验:称取3批(批号分别为1121007，1120527，1120102)已知含量的样品，每批3份，精密称定，分别加入对照品适量，按2．2项下方法制备供试品溶液，测定其含量，计算回收率，结果见表1。

检测下限考察:取EDTA溶液(0．51 g/L)1 mL，置10 mL容量瓶中制成混合液[1]，取混合液依次稀释至1 000倍时，信噪比[2](S/N)约为 10。检测限质量浓度约为 0．51 μg/mL。

表1 EDTA加样回收试验结果(n=6)

2．4 样品含量测定

精密量取本品适量(相当于EDTA 2．5 mg)，置50 mL容量瓶中，加水适量，加1%的硫酸铜溶液10 mL，加水稀释至刻度，摇匀，以 0．45 μm 的微孔滤膜滤过，精密量取 20 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，另精密称取EDTA 25 mg，置50 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，精密吸取5 mL置50 mL容量瓶中，加1%的硫酸铜溶液10 mL，加水稀释至刻度，摇匀，以0．45 μm的微孔滤膜滤过，同法测定，按外标法以峰面积计算，结果批号分别为1121007，1120527，1120102的样品EDTA含量分别为 4．43，4．41，4．61，4．71，4．57，4．51 mg/瓶。

3 讨论

由于EDTA易与金属离子络合，在色谱柱中，EDTA和色谱柱不锈钢表面会发生络合，导致EDTA的相应值变低峰形严重拖尾。本法采用硫酸铜溶液，使EDTA和铜离子形成比较稳定的络合物，可以避免EDTA和色谱柱不锈钢表面发生作用，提高检测灵敏度，改善峰形。研究表明，1%的硫酸铜溶液的用量为10 mL时，EDTA的峰形较好，故以此作为反应浓度。

在加硫酸铜溶液进行反应时溶液会发生浑浊，因此在反应完成后，用0．45 μm的微孔滤膜过滤，防止堵塞和污染色谱柱，同时也降低了对EDTA测定的干扰作用。采用本法测定替硝唑氯化钠注射液中EDTA的含量，具有简捷方便，结果准确，灵敏度高，色谱峰峰形好，分离度好的特点。

[1]国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[M]．中国医药科技出版社，2010:140，622，附录ⅩD．

[2]张俊松，戚 燕，王晓利，等．注射用奥美拉唑中微量EDTA的检查[J]．药物分析杂志，2006，26(12):1 721-1 722．