饲用枯草芽孢杆菌表达系统研究进展

杨明明，陈玉林

(西北农林科技大学 动物科技学院 陕西 杨凌 712100)

枯草芽孢杆菌是广泛存在于土壤和动物胃肠道的一类革兰氏阳性菌,因其易于分离培养，具有较清晰的遗传背景和良好的分泌性，又无致病性等特点，已成为重要的工业菌种，被越来越多地应用于畜牧业生产中[1-3]。近年来，随着分子生物学技术和基因工程技术的发展，利用重组枯草芽孢杆菌生产饲用酶、饲用活性代谢产物以及作为肠道益生菌成为热点研究领域。然而，本研究领域经过近十年的发展，虽然已有一些可用于枯草芽孢杆菌的表达系统，但仍存在如嵌合载体拷贝数低、转化方法效率低、启动子活性低、目标基因表达量低等问题，严重限制了枯草芽孢杆菌在饲用酶和益生菌工业生产中的应用和发展[4-6]。本文将对枯草芽孢杆菌表达系统的载体和启动子元件作一简要综述，以期为饲用枯草芽孢杆菌的表达系统研究和应用提供基础材料。

1 枯草芽孢杆菌的表达系统概述

枯草芽孢杆菌作为研究革兰氏阳性菌的模式菌，具有遗传和生理生化背景清晰、蛋白分泌性好和非致病性的特点，被认为是生物安全级别的微生物，目前作为重要的益生菌和饲用酶生产菌种，在饲料工业中被广泛利用[1-2]。

随着现代DNA重组技术的发展和枯草芽孢杆菌全基因组DNA测序的完成，枯草芽孢杆菌基因工程得到了进一步的发展。其作为基因工程菌的出发菌具有巨大潜力和优势[6-8],主要是因为：① 非致病性，广泛存在于动物肠道微生物区系，被认为是动物肠道益生菌；② 具有易于摄取外源DNA的特点，噬菌体和质粒都可以用作克隆载体，便于 DNA 的遗传操作；③ 枯草芽孢杆菌分泌蛋白种类多，蛋白分泌系统功能完善，当分泌蛋白跨过细胞膜后，可直接释放到培养基中，用于饲用酶生产时，回收和纯化方法简单；④ 培养基配方简单，发酵技术成熟，益生菌和饲用酶的工业化生产容易实现；⑤ 细胞壁组成简单，只含有肽聚糖和磷壁酸，因此在饲用酶产品中不含内毒素(热源性脂多糖)，在饲用酶的生产上具有极大的优势。

采用枯草芽孢杆菌的高效表达系统实现有生产价值蛋白的高产，是现代饲用酶和重组益生菌的热点研究领域[9]。目前，在原核微生物中，大肠杆菌的分子生物学研究发展最早，表达系统相对完善[10]。典型表达系统主要有Lac启动子、Tac 启动子、PL启动子、PR启动子和T7启动子表达系统等[11-14]。

与大肠杆菌表达系统相比，枯草芽孢杆菌的遗传操作体系还很不完善，这极大地限制了枯草芽孢杆菌基因工程技术的发展与应用[4-6,15]。

值得注意的是，枯草芽孢杆菌的基因表达具有自身的特点，在对数生长期后逐渐进入芽孢形成期，在不同的生长阶段基因表达不同，具有不同时序性的多种Sigma因子[16-17]。Sigma因子是RNA聚合酶全酶(α 2 β β')的 5个亚基之一，它协助核心酶识别特定的启动子序列，并结合于转录起始部位。目前，关于枯草芽孢杆菌sigma因子，已知的不少于11种。另外，枯草芽孢杆菌能将蛋白大量分泌至培养基中。通过生物信息学预测，枯草杆菌有将近200个潜在的信号肽序列，目前已有147得到验证，正是信号肽介导了蛋白的胞外分泌[15,18-19]。枯草杆菌有强的胞外蛋白分泌能力，适用于工业化生产。但是由于自身胞外蛋白酶表达量大，容易引起目标蛋白的降解，目前通常的解决方法是采用蛋白酶缺陷株作为宿主[20]。然而，枯草芽孢杆菌能自发形成感受态的菌株极少，感受态持续时间短暂，分子克隆效率低限制了它的遗传操作。且与大肠杆菌相比，枯草杆菌中遗传操作方法不完善，基因工程构建难度较大，导致了现有表达系统的资源少且不成熟。

目前，在枯草芽孢杆菌中常用的表达系统是Pspac和Pxyl启动子系统。Pspac启动子采用枯草芽孢杆菌噬菌体sp01的启动子和lac操纵元的调节基因嵌合构建而成，其构建参考了大肠杆菌Tac启动子的构建思路，利用了lac操纵元的调节基因，从而可以用IPTG进行诱导表达调控[21-24]。但与大肠杆菌的启动子系统相比，其调控的精确性较差，表达强度较弱；Pxyl启动子系统则是利用木糖操纵元启动子构建而成，该系统以木糖为诱导物激活转录。这两个诱导表达系统目前在枯草杆菌的研究工作中应用较广，但Pspac系统的诱导物IPTG对宿主有毒性，而Pxyl启动子系统的诱导物木糖价格昂贵，因而限制了它们在实际生产中的应用[25-27]。可见，缺乏成熟有效的调控元件，是枯草芽孢杆菌表达系统不完善的重要原因之一。

2 枯草芽孢杆菌载体

在微生物的遗传操作中，质粒是进行基因克隆和表达的基本工具[28-30]。枯草芽孢杆菌内源性质粒DNA很少，目前在枯草芽孢杆菌遗传操作中使用的质粒DNA大部分来源于葡萄球菌(staphylococci)和链球菌(streptococci)等其他微生物[31-36]。这些质粒依据其复制类型可以分为蝶形复制型(θ复制型)和滚环复制型质粒[37-40]。

θ复制型质粒较大，拷贝数很低，难以方便地用于遗传操作[41]。滚环复制型质粒大多为小型质粒(﹤10 Kbp)，通常采用以解链的单链DNA(ssDNA)为中间体进行复制。这类质粒的复制机制、结构域和功能特点具有高度的相似性，它们通常具备以下功能区域：抗性基因(隐性质粒缺乏该功能区)，主要复制单元，次要复制起始点和一个开放性阅读框。虽然这4个功能区在不同的质粒中可能排列顺序有差异，但相应的功能区的DNA序列及其编码的蛋白质具有高度同源性。

主要复制功能单元(最小复制子)由编码复制起始蛋白(Rep)的基因和复制起始点(正链合成起始点，ori )组成；次要复制功能单元，又称负链起始点(MO)，是合成负链的起始点。MO对于负链合成有重要影响，质粒缺乏MO时，细胞内单链DNA的水平大量增加，而单链DNA的积累通常会加剧质粒的不稳定性。目前所知道的MO主要有三个家族，即palA型，palU型和palT型。palA型MO在枯草杆菌中没有功能，在枯草杆菌中具有不稳定性。palU型(又称BA3型)MO在枯草杆菌中有功能，相对比较稳定。palT型MO在枯草杆菌中有功能，并因为有一定种属亲缘性，因此作为枯草杆菌的稳定性质粒。

枯草芽孢杆菌中常用的滚环复制型质粒主要有以下几种。

2.1 来源于金黄色葡萄球菌的质粒

pUB110是一个被完全测序的质粒(4 548 bp)，抗性基因为卡那霉素(或新霉素)和博莱霉素。该质粒的拷贝数约为50个/染色体，相对稳定[42-43]。但pUB110的一些衍生质粒，如pBD64和pLB2/pLB5，往往因为缺少MO,而造成高度的结构和分离不稳定性，实际应用价值不大。

pC194质粒大小为2 906 bp，拷贝数约为15个/染色体[44]。质粒较小，利于克隆，但是由于是palA型MO，容易产生大量的ssDNA，且在插入异源片段时还会产生大量高分子量畸形复制产物(HMWDNA)，造成了它的高度不稳定性，也不适合用于分子操作。

pE194质粒大小为3 728 bp，拷贝数大约10个/染色体，其衍生质粒cop-6，拷贝数可达100个/染色体，拷贝数高，但由于也是palA型MO，所以在枯草杆菌中很不稳定[45]。

pE194质粒的复制具有温度诱导性，正常复制温度为32 ℃时，随着培养温度的增加，质粒拷贝数下降，温度达到45 ℃时，质粒复制停止。pE194 Ts是质粒pE194的突变体，其在38 ℃就丧失了复制功能。利用该质粒的温度敏感性，可以实现在枯草杆菌染色体DNA中多位点整合。通过改变温度条件，使得目标基因在染色体DNA中多拷贝整合，得到遗传稳定性高的重组菌。但由于操作步骤相对复杂，所以在实际的遗传操作中应用较少。

2.2 来源于干燥棒状杆菌的高拷贝质粒

pTZ12(约2 517 bp)是一个编码氯霉素抗性基因，来源于corynebacterium xerosis的质粒[46]。 pTZ12能够在枯草杆菌中复制并保持高的拷贝数(大约150～200个/染色体)。pGDV1是pTZ12的衍生质粒，在pGDV1中引入了pUC18的多克隆位点便于基因的克隆[47-50]。 pGDV1也是一个高拷贝的质粒，但因为它在大肠杆菌中无法复制，而枯草杆菌转化效率相对较低，分子操作不便，所以需要将它进一步构建为大肠杆菌——枯草芽孢杆菌穿梭载体，以求在研究中更加方便高效地应用。

2.3 来源于乳酸菌的质粒

基于小型乳酸菌隐性质粒pWV01(2 178 bp)，及与之高度相近的质粒pSH71，构建了一系列灵活方便的小型质粒载体[51-52]。但是这两个质粒及它们的衍生质粒在枯草杆菌中的拷贝数都很低，不便于分子操作。

2.4 来源于杆菌的质粒

来源于杆菌属的质粒因为与枯草芽孢杆菌种属的接近，可以形成相对稳定的宿主-质粒系统，如质粒pTA1060，pLS11和pBAA1，以及和pUB110复制功能极为相似的pBC16[53-54]。可是，这些质粒仍有一些自身缺陷，如pTA1060稳定性较好，但质粒偏大(8.6 k)，且在枯草杆菌中拷贝数低至5个/染色体，限制了其在枯草芽孢杆菌遗传操作中的应用。它的小型衍生质粒pHP13(4.9 bp)带红霉素和氯霉素抗性，插入的pUC9的lacZ基因使它可以在大肠杆菌中方便的筛选，在枯草芽孢杆菌限制性缺陷株中有较高的克隆效率，是一个有用的大肠-枯草杆菌穿梭载体，但它依然存在拷贝数低的问题，不便于广泛应用。

以上质粒虽然能够在枯草杆菌中进行克隆操作，但他们普遍存在质粒的不稳定性问题[31,33,36]。质粒的不稳定性包括分离不稳定和结构不稳定。分离不稳定是指在宿主生长分裂过程中质粒丢失，而结构不稳定是质粒在复制过程中由于自身重排造成缺失。滚环复制型质粒在复制中产生单链DNA (ssDNA)分子和高分子量畸型复制产物(HMW DNA)，这是造成这两类不稳定性的重要因素。

质粒的不稳定性严重限制了其在研究工作中的实际应用，而且在革兰氏阳性菌的遗传操作中，体外连接的双链质粒DNA分子直接转化宿主效率极低[38-39]。由此造成了枯草杆菌中分子遗传操作的极大不便，使得目标基因难以直接在枯草杆菌中克隆和表达。而大肠杆菌的质粒系统和操作技术比较完善，质粒的稳定性好。因此，采用大肠杆菌—枯草芽孢杆菌穿梭载体的策略，前期的基因克隆在大肠杆菌中进行，然后再转化入枯草杆菌中，是一个行之有效的方式。而且，穿梭载体还有利于进行两个菌在基因表达和蛋白分泌等方面的比较性研究，对研究两个菌的质粒接合转移也很有意义。因此，大肠杆菌—枯草杆菌穿梭质粒载体是建立枯草杆菌遗传操作体系的重要基础。

3 枯草芽孢杆菌启动子

原核微生物的启动子通常包含 -10序列、-35序列和转录起始点等保守型元件。-10区和 -35区之间的距离影响基因转录强度，大部分原核启动子的 -10和 -35区域的间距为16～19 bp，当间距超过这一范围时启动子的强度不同程度降低或失去活性[55-57]。但在原核微生物中亦存在缺乏 -35或 -10的启动子，在辅助蛋白质作用下，RNA聚合酶才能识别这种启动子[58-59]。除了 -10和 -35序列，其附近的DNA序列也能影响启动子的强度。在枯草芽孢杆菌的一些启动子 -35区上游含有丰富AT的碱基对，通过删除或突变试验发现AT富含区增强基因的转录，称之为转录增强区。在启动子转录起始点的 -10区到 +1之间转载另一个AT富含区，一般为4～7 bp，该区域在转录起始时促进DNA的局部解链[60]。

3.1 组成型启动子

组成型启动子即持续性表达蛋白的启动子，可用作调控元件构建表达载体实现目标蛋白的胞内或胞外大量表达，如P43启动子[61-62]。此外，在枯草芽孢杆菌的遗传操作中蛋白酶的基因的调控序列、α-淀粉酶基因的启动子常被用作分泌表达的调控元件。组成型启动子通常表达量较高，成本较低，但存在对宿主生长有害的蛋白难以和表达可控性差的缺陷[63-64]。

3.2 诱导型启动子

与组成型启动子相比，诱导型启动子具有快速开启或关闭基因转录等独特优势，可以根据需要，调控基因的表达。根据诱导方式，这类启动子可以分为两种：环境应答型启动子和化学诱导型启动子。环境应答型启动子在特殊环境下(如热休克、高盐和缺氧等)，可启动基因的转录，使微生物能快速的适应环境的变化[65-66]。化学诱导型启动子则由诱导物来调控基因的表达[21,24]。

化学诱导启动子在化学诱导物存在时，改变基因的转录水平。通常化学诱导物与转录因子结合，激活或抑制目的基因的表达。理想的化学诱导启动子在无诱导物时启动子无转录活性或表现低转录活性，同时诱导物应该具有快速应答效应、诱导的专一性和无毒或低毒[21,24-25]。

在枯草芽孢杆菌的基因工程中，常用的化学诱导系统有Pspac、Pxyl和PsacB系统等[21,65,67]。Pspac启动子是一个杂合启动子，由SPO1(枯草杆菌烈性噬菌体)的早期启动子和大肠杆菌乳糖操纵元的阻遏蛋白结合位点嵌合而成，在IPTG诱导下可实现高水平的表达；Pxyl启动子是由来自巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的木糖操纵元构建而成，包括木糖启动子Pxyl和阻遏蛋白基因xylR。木糖诱导时，诱导物与阻遏蛋白XylR结合，阻止了XylR对Pxyl启动子转录的阻断，从而诱导基因表达。该系统调控严谨，诱导效率高；PsacB 启动子则是利用自身的可控元件来实现外源基因的诱导表达。sacB启动子和结构基因之间有-茎环结构，称为sacR区，是一个受蔗糖调控的转录终止序列。无蔗糖诱导时，转录终止；蔗糖诱导时，sacR区的转录终止作用就失效，启动子激活。

这三个启动子系统在枯草杆菌研究工作中应用很广，但它们也有自己的缺点：Pspac启动子的诱导物IPTG不仅成本高，而且有毒性；Pxyl启动子的诱导物木糖价格高，易增加生产成本；sacB启动子的表达量相对比较低。这些缺陷使得它们在工业生产中有一定的局限性。

此外，枯草芽孢杆菌中的麦芽糖启动子，也具有很好的应用潜力[68]。该操纵元由编码 6-磷酸-葡萄糖苷酶(GlvA)的基因，调控蛋白(YfiA，即GlvR)基因和磷酸烯醇丙酮酸酯—糖磷酸转移系统透性酶(GlvC)基因以及它们的调控元件组成。GlvA蛋白由449个氨基酸组成，该酶需要NAD(H) 和二价金属离子才能有活性；GlvR由254个氨基酸组成，其氨基酸序列和RpiR/YebK/YfhH家族有很高的相似性；GlvC含527个氨基酸，是一个有12个跨膜区域的PTS转运酶。培养基中的麦芽糖在被GlvC转运入枯草芽孢杆菌胞质的同时被磷酸化成为6-磷酸麦芽糖，GLVR与6-磷酸麦芽糖结合后被激活，从而与Pglv启动子结合促进了其转录强度。同时，6-磷酸麦芽糖可在胞内被GlvA水解成6-磷酸葡萄糖，而在Pglv启动子的转录起始点和核糖体结合位点之间，有一个典型的代谢反应元件cre序列(catabolite repression elements)，因而葡萄糖特异性反馈抑制麦芽糖操纵元的转录。

Pglv系统的诱导物麦芽糖相对于IPTG和木糖来说，价格便宜，成本低，且对细菌本身无毒性，因此在工业生产上很有实用性价值。但其同时也存在着不足，即发酵代谢产物葡萄糖对麦芽糖启动子有强烈的反馈抑制作用，这是对该启动子元件应用应用的一个重大制约。

4 枯草杆菌表达系统的现状及发展方向

基因表达是一个复杂的系统，枯草杆菌的基因表达具有以下特点：①枯草杆菌及其噬菌体在不同生长时期或不同生长环境中，所表达基因的种类和程度各不相同；②转录多σ因子。这些σ因子是级联式交替进行作用的，符合σ因子级联基因调控模型；③枯草杆菌中有多种信号肽，因此蛋白可大量跨膜分泌至培养基中。

4.1 现有的枯草芽孢杆菌表达系统

完善的枯草芽孢杆菌胞内表达系统应该包括两个方面：稳定且高拷贝的载体骨架及可控性好的强启动子[23,28-30]。

在载体骨架方面，如前文所述，枯草芽孢杆菌常用质粒载体的稳定性和质粒大小有关(如pUB110类质粒载体)，当质粒载体太大会引起分离不稳定。而在实际操作中，为了让质粒载体变小，在枯草杆菌中有功能的palU型MO常被删掉，增加了质粒在枯草芽孢杆菌中的分离不稳定。而由枯草杆菌隐性质粒与大肠杆菌质粒构成的嵌合载体, 如由枯草杆菌隐性质粒pTA1060与pUC19构成的穿梭质粒pHB201，虽然相对较稳定，但拷贝数低(5个/染色体)，这限制了它的表达量；采用整合质粒将克隆基因整合到宿主染色体是克服枯草杆菌质粒不稳定性的一个有效途径，但是它也同样存在拷贝数低和表达量低的问题。

在启动子方面，组成型启动子P43，诱导型启动子Pspac，Pxyl和PsacB都是可以应用的启动子[21,25-26,67]，但也有各自的缺点。

胞内表达系统是构建工业化生产基因工程菌的基础。基因重组即将天然或人工合成的目的基因，克隆到表达载体上，然后将重组DNA分子导入到宿主菌中，从而得到目标蛋白高效表达的生产菌株。因此，构建可方便操作且稳定性好的载体骨架；筛选调控精准，诱导物安全低廉的强启动子元件，对于发展枯草杆菌的基因工程，获得高效的工业化生产菌种，具有至关重要的作用。

4.2 枯草芽孢杆菌表达系统的发展趋势和展望

近年来，随着枯草芽孢杆菌基因工程的发展和完善，各种与工业发酵有关的基因获得成功表达，如乙醇、有机酸醇、氨基酸、维生素等合成途径的调控基因和关键酶基因；很多饲用酶获得高效表达，如中性蛋白酶和淀粉酶等。

外源基因在枯草芽孢杆菌的转化是实现基因表达的必要条件。目前，枯草芽孢杆菌中应用最广泛的宿主菌株是容易进行感受态转化的168菌株及其突变体。这些突变体包括各种营养要求、芽孢形成和萌发、蛋白酶缺失、重组缺陷、限制/修饰系统缺陷、转座子插入等方面的突变体。枯草芽孢杆菌168菌株的全基因组测序已于1997年完成，可方便地进行查询和比对[68]。

可以预见，随着基因工程的进一步发展，枯草杆菌的表达系统将会按新的思路改进并具有更为广阔的应用前景。

(1)更小，拷贝数更高的质粒载体的构建。在保证全部复制功能的前提下，质粒越小，分子克隆越方便，而拷贝数的高低是决定表达量的关键，因此构建小而且高拷贝的质粒是实现高效表达的重要基础。

(2)质粒的稳定性和安全性将进一步提高。随着基础研究和操作手段的进一步深入，质粒的稳定性问题将会进一步得到解决。例如目前新的研究方向-无抗性标记系统，可以考虑将宿主的某必需基因敲除，而用质粒载体携带该基因转化入宿主菌，这样由于宿主菌只有在此质粒存在时才能存活，从而保证了稳定的宿主-质粒系统。同时，这样可以省略转化时的抗性标记，因为存活的菌株必然含有此质粒，这样在培养基中就不必加入抗生素，这即可降低工业化生产成本，又可以减少抗性基因对环境的污染。

(3)遗传操作方法的进一步优化。枯草杆菌中的遗传操作方法不如大肠杆菌中完善，尤其转化效率低，更是分子操作中的瓶颈问题。由于枯草芽孢杆菌的细胞壁结构比革兰氏阴性菌复杂，故其转化条件要求更苛刻，且操作较为繁琐。因此进一步优化转化方法，使其能更方便高效，具有重要的意义。

(4)调控方式更简单有效的表达系统的建立。例如采用压力调控系统，通过温度，渗透压，氧浓度等方式来调控，诱导方式简单而成本低。这需要进一步对相关表达元件及其调控方式进行研究，在功能研究清楚的基础上加以有效的应用。

(5)强启动子的筛选。这需要对枯草杆菌以及其他相关菌株的启动子进行进一步系统性的筛选和鉴定，从而得到更好的表达元件，这也是实验性地验证枯草杆菌基因组调控元件的重要途径。

(6)高效分泌系统的建立。在好的表达载体骨架的基础上，系统性地研究信号肽与特定目的基因的适配性，从而找出最适合的信号肽，最终实现外源基因在枯草杆菌的高效分泌表达。这对于枯草杆菌的工业化应用具有重要意义。

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