发酵床陈化垫料腐解复合微生物菌剂筛选

尹红梅，陈文辉，王 震，刘 标，杜东霞，贺月林

（湖南省微生物研究所，湖南长沙410009）

随着养殖业特别是规模化、集约化养殖的迅猛发展，畜禽粪尿造成环境污染问题越来越严重，加强畜禽粪尿污染的防治已迫在眉睫［1］。发酵床技术是为了实现畜禽粪尿原位降解的新型养殖技术［2－4］。发酵床在使用过程中，其垫料有一定使用寿命，如何对废弃的陈化垫料进行处理是发酵床养猪技术中一个急需解决的关键问题。目前对陈化垫料处理方式有再生和堆肥2 种，最主要的处理方式为堆肥。

堆肥处理是依靠堆肥中含有各类微生物在分解有机物中交替出现，使堆温上升、下降，从分解水溶性有机物开始，逐渐分解难分解和抗分解的有机物并转化为腐殖物质的生物化学过程［5］。发酵床陈化垫料主要由没有完全分解的猪粪与纤维素、木质素含量高的锯木屑和稻壳组成。由于腐殖质在木质纤维素腐解过程中形成，加强木质纤维素的腐解便成为堆肥充分腐熟的关键。就生物降解难易而言，纤维素属难分解物质，木质素属抗分解物质。自然界只有少数微生物能分解木质素，其彻底分解需几个月甚至1～2年时间。因此，探讨加速陈化垫料堆肥有机物腐解，缩短堆肥时间，具有重要的实用意义。

1 材料与方法

1.1 菌剂

①Kc∶Kn∶Gf＝1∶1∶1，活菌数为1.0×109cfu／mL；②Kn∶Gf＝1∶1，活菌数为1.0×109cfu／mL；③Kc∶Kn ＝1∶1，活菌数为1.0×109cfu／mL；④Kc∶Gf＝1∶1，活菌数为1.0×109cfu／mL。以上菌种均为实验室分离保存：Kc为枯草芽孢杆菌（产蛋白酶能力强，在发酵液中反应24 h后，蛋白酶活达806 U／mL），Kn为康宁木霉（产纤维素酶能力强，在发酵液中反应24h后，纤维素酶活达215 U／mL），Gf为高温放线菌（耐高温，最适生长温度为50 ℃），三菌株之间无拮抗作用。

1.2 试验材料

本试验中，陈化料与猪粪来自湖南新五丰韶山分公司养猪场（主要成分见表1）。陈化垫料与猪粪混合比例为3∶2（重量比），C／N 比为25∶1，水分含量55%左右。

1.3 试验设计

1.3.1 堆肥池规格 堆肥池的长1.0 m、宽1.0 m、高1.5m。

1.3.2 试验分组 试验分5组，处理1、处理2、处理3、处理4分别接种0.2%的①、②、③、④微生物菌剂，CK 为对照组，不接种微生物菌剂，通气方式采用人工翻堆。

1.4 样品采集

分别在第0d、5d、10d、15d、20d、25d采样，采样点位于垫料表层下30cm 处，分前、后、左、右、中5点，每次采5个混合样，取其平均值。

表1 试验原料主要成分Table 1 Initial conditions and composition of the material composting

1.5 测定指标与方法

试验期内每天11∶00～12∶00，测定发酵料表面下30cm 处温度及pH；有机质采用灼烧法测定；全氮采用凯氏定氮法测定；木质素采用酸性洗涤灼烧法测定；纤维素采用浓酸水解灼烧法测定；大肠菌群采用煌绿乳糖胆盐发酵MPN 计数法；种子发芽率测定参照文献［6］方法进行：将鲜样用蒸馏水按水肥比10∶1充分震荡1h，30 ℃浸提1昼夜，用纱布过滤，滤液以3 000rpm 离心10min，吸取8mL 上清液加到铺有1张滤纸的12cm 培养皿内，每个培养皿均匀点播20粒饱满的萝卜种子，放置在（25±1）℃恒温培养箱中培养，第72h测种子发芽率.每个处理重复3次，对照为清水。计算公式：发芽率指数＝［（浸提液中的种子发芽率×种子根长）／（蒸馏水中的种子发芽率×种子根长）］×100%。

1.6 数据统计分析

采用SPSS16.0 统计软件进行单因子方差分析，并用Duncan新复极差法进行多重比较。

2 结果与讨论

2.1 温度变化

温度是判定堆肥能否达到无害化要求的最重要指标之一。堆肥过程中，堆体温度应控制在45～65℃，但在55～60 ℃时较好［7］。如图1所示，各试验组温度变化趋势基本相同，均可分为3个时期即升温期、高温期、降温腐熟期。处理组都在1～3d进入高温堆肥阶段（＞50℃），但在50℃以上维持时间不同，其中处理1时间最长为13d，随后依次为处理3、处理4、处理2，高温保持的时间分别为10d、10 d、6d，而对照组CK 仅为4d。统计分析表明：4个处理组之间堆肥过程中平均温度无显著差异（P＞0.05），处理1、处理3、处理4与处理2、CK 之间堆肥过程中平均温度差异显著（P＜0.05）。上述结果表明，接种微生物菌剂有利于延长堆肥高温时间，有利于微生物的生长和繁殖，从而更好地促进有机质降解。

2.2 pH 变化

由图2可知，堆肥过程中，所有试验组pH 均维持在7.5～9.0之间。全程而言，pH 变化有一个先上升后下降趋势。至堆肥结束时，所有处理组pH在8.0～9.0之间，符合腐熟堆肥pH 应在8.0～9.0的标准［8］，对照组CK 的pH 为7.68，没有达到堆肥腐熟标准。统计分析表明：4个处理组之间平均平均pH 差异不显著（P＞0.05），但均与CK 组差异显著（P＜0.05）。

2.3 C／N 变化

各堆肥组C／N 变化如图3示。堆肥过程中氮相对含量随着堆制天数的延长有增加的趋势，有机质含量随着堆制天数的延长逐渐降低。分析表明，氮和有机质含量的变化主要发生在堆肥后第5d至第20d之间，此后渐趋稳定，这表明堆肥降温腐熟期是氮、有机质含量发生变化的主要时期。此期微生物不断以碳源物质为能源，利用堆肥基质中的各种养分合成自身所需物质，碳源物质含量不断下降，全氮绝对含量减少，但相对含量增加。堆肥结束时，4个处理组及CK 碳氮比分别为18.5、19.9、19.3、19.2、20.9。统计分析表明：堆肥结束时，各组碳氮比差异不显著（P＞0.05）。在堆肥过程中，处理1的C／N 比下降最快，可能是因为处理1添加的微生物菌剂最利于促进堆肥中有机质的分解。

图1 堆温变化Fig.1 Changes of temperature during the composting

图2 pH 变化Fig.2 Changes of pH values during the composting

2.4 木质素与纤维素降解率

各试验组对纤维素与木质素降解率如图4、图5所示。由图4、5可知，所有试验组的变化趋势相似，在前期几乎没有降解，到中后期才表现出较强的降解效果。试验结束时，4个处理组对纤维素的降解率分别为47.6%，38.7%，43.1%，43.5%，而对照组CK 纤维素降解率只有19.7%；4个处理组对木质素的降解率分别为30.2%，23.8%，25.9%，27.5%，而对照组CK 木质素降解率只有13.6%。统计分析表明：试验结束时，4个处理组与CK之间的木质素与纤维素降解效率差异均显著（P＜0.05），其他各组之间无显著差异（P＞0.05）。其中处理1对木质素与纤维素的降解率均最高。

图3 C／N 变化Fig.3 Changes of C／N ratio during the composting

图4 纤维素降解率Fig.4 The degradation rate of cellulose during the composting

2.5 种子发芽率

用生物学方法测定堆肥的毒性，是检验有机质腐熟度的一种直接且有效的方法［9］。种子发芽率不但能检测堆肥样品的毒性，而且能预测堆肥毒性的发展［10］。如果GI＞50%，则可认为基本无毒性，当GI达到80%～85%时，这种堆肥就可以认为是对植物没有毒性［11］。从图6可以看出，不同堆制时间对种子发芽的抑制作用不同。堆制初期的堆肥几乎完全抑制种子发芽，这种抑制作用随堆制时间的延长而逐渐降低，种子发芽率逐步上升，20d左右种子发芽率的变化趋于稳定。堆肥至20d时，处理13～10d，这种下降表现最为明显，亦即堆肥的高温期是杀灭病原菌的最主要时期。而对照组CK 由于发芽率指数达82.1%，其他处理组在80%以下。至堆肥结束时，处理1、处理2、处理3、处理4、CK 种子发芽率指数分别为98.5%、81.2%、88.5%、89.3%、62.3%。统计分析表明：堆肥结束时，处理1、处理2、处理3、处理4之间发芽率指数差异不显著（P＞0.05），均与对照组差异显著（P＜0.05）。从种子发芽率指数来看，堆肥结束时除对照组CK 没有腐熟外，其他试验组堆肥都已腐熟，其中处理1 在20d时，发芽率指数达82.1%，腐熟时间最短。

图5 木质素降解率Fig.5 The degradation rate of lignin during the composting

图6 发芽率指数的变化Fig.6 Changes of GI during the composting

2.6 大肠菌群

如表2所示，随着堆肥进程的延长，所有试验组大肠菌群表现出明显的下降趋势。特别在堆肥的前整个堆肥时期高温维持时间短，虽所含大肠菌群呈逐步下降趋势，但至堆肥结束时大肠菌群含量维持在103cfu／g，仍达不到粪便无害化标准；而所有处理组在堆肥后3～10d时已基本维持在101～102堆肥的数量级，符合粪便无害化标准，尤其处理1与处理4在堆肥结束时，检测不出大肠菌群。

表2 大肠菌群的最可能数Table 2 Most probable number of coliform cfu／g

3 小结

C／N、种子发芽率是较好地反映堆肥的腐熟进程的生化指标，当C／N 降至20∶1以下、种子发芽率大于70%时，可判定堆肥已腐熟。依据上述指标，并结合粪便无害化标准，可得出本研究中除对照组CK外，其余各试验组在第18～25d时堆肥已腐熟。

在添加微生物菌剂的的各试验组中，处理1效果最好，高温保持的时间为13d，至堆肥结束时对纤维素、木质素的降解率分别为47.6%，30.2%，种子发芽率指数为98.5%，大肠杆菌未检测出。

［1］杨朝飞.加强禽畜粪便污染防治迫在眉睫［J］.环境保护，2001（2）：32－35.

［2］贺月林，尹红梅，周庆华，等.消毒剂对生物发酵床中有益菌数量与酶活性的影响［J］.畜牧与兽医，2011，43（10）：21－25.

［3］朱 洪，常志州，王世梅，等.基于畜禽废弃物管理的发酵床技术研究Ⅱ.接种剂的应用效果研究［J］.江苏农业科学，2007，（2）：228－232.

［4］黄振兴，陈 谊.猪粪尿零排放无污染研究与可行性探导［J］.上海畜牧兽医通讯，2001，6：10－11.

［5］史家栋.环境微生物学［M］.上海：华东师范大学出版社，1993.

［6］汤江武，吴逸飞，薛智勇，等.畜禽固弃物堆肥腐熟度评价指标的研究［J］.浙江农业学报，2003，（5）：293－296.

［7］Fumihito M，Kazunori I.Effect of high compost temperature on enzymatic activity and species diversity of culturable bacteria in cattle manure compost［J］.Bioresource Technology，2005，96：1 821－1 825.

［8］李艳霞，王敏健，王菊思.有机固体废弃物堆肥的腐熟度参数及指标［J］.环境科学，1999，20（2）：98－103.

［9］Zucconi F，Forte M，Monae A，et a1.Biological evaluation of compost maturity［J］.Biocycle，1981，22：27－39.

［10］Mathur S P.Bioconversion of waste materials to industrial products［M］.New York：Composting Processes，1991：147－186.

［11］黄国锋，钟漉举，张振钿，等.猪粪堆肥化处理过程中的氮素转变及腐熟度研究［J］.应用生态学报，2002，13（11）：1 459－1 462.