仙鹤草对2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗及炎性因子的干预作用

秦灵灵　王磊　李娟娥　刘铜华

仙鹤草，又名脱力草、龙牙草，系蔷薇科植物龙牙草的干燥地上部分，野生于中国各地。仙鹤草性平，味苦涩，归心、肝经，具有收敛止血、截疟、止痢、解毒的功效，临床上传统用于各种出血症[1]。据报道仙鹤草中含有酚、酯、黄酮、鞣质、糖苷、有机酸、挥发油、三萜皂苷等极其复杂的化学成分[2]。

1　材料与方法

1.1动物

SPF级Wistar大鼠60只，雄性，8周龄，体重(180±20) g，合格证号：SCXK(京)2006-0009。

1.2药物与试剂

仙鹤草提取物由北京中医药大学中药学院提供：仙鹤草全草饮片5 kg，加水煎煮3次，料液比分别为1∶10、1∶10、1∶8，煎煮时间分别为：1.5、1.5、1小时，分别过滤合并滤液，滤液减压浓缩至稠膏，70℃真空干燥，粉碎，过80目筛，得仙鹤草提取物0.5925 kg(得率11.85%)；艾汀(盐酸吡格列酮片)15 mg/片，由江苏太洋医药股份有限公司制造，国药准字批号：H20040267；链脲佐菌素(STZ)(sigma0130)购自北京博爱商贸有限公司，批号：B57218；血脂4项生化试剂盒、胰岛素放免试剂盒，C反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)放免试剂盒购自南京建成生物有限公司。

1.3实验仪器

低温高速离心机(3κ30，美国Sigma公司制造)；酶标仪(Multiskan MK3型，Thermo制造)；水浴锅(荣华仪器厂)；血糖仪及配套试纸(德国罗氏罗康全)。

1.4饲料

造模大鼠喂养的高脂饲料，购自北京科奥协力饲料有限公司，配方：基础饲料65.75%，蔗糖20%，猪油10%，蛋黄粉3%，胆固醇1%，猪胆盐0.25%，正常组大鼠喂养普通饲料。

1.5动物分组及给药

动物饲养于北京中医药大学SPF级动物实验室，每天12小时光照维持，昼夜循环，自由饮水进食。动物适应性喂养1周后，按照随机数字表随机选取9只为正常对照组，以普通饲料喂养，其余大鼠以高脂饲料喂养。在饲养4周后，夜间禁食12小时后腹腔注射STZ(30 mg/kg溶于0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液，pH=4.4)；2周后测定大鼠空腹血糖，测得非同日两次血糖值≥16.7 mmol/L者为模型成功大鼠。选取造模成功的36只大鼠按血糖高低编号，并按照随机数字表随机分为模型组、吡格列酮组(4.05 mg·kg-1·d-1)、仙鹤草高剂量组(12 g·kg-1·d-1)和仙鹤草低剂量组(6 g· kg-1·d-1)，中药以生药量计，灌胃给药4周。正常组和模型组予相同体积的生理盐水。

1.6取材

取材前禁食不禁水12小时，断尾取血测其空腹血糖(FBG)，腹腔注射3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，腹主动脉取血，常温静置3小时，2500 g，4℃离心10分钟，血清，-20℃保存。

1.7观察指标

1.7.1一般情况观察观察大鼠毛色、神态、精神状态、活动度等情况，随时记录。

1.7.2血清指标用德国罗康全血糖仪及配套试纸测定空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)空腹血清胰岛素(fasting serum insulin,Fins)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和C反应蛋白(c-reactive protein，CRP)用放免法测定，甘油三酯(triglyceride，TG)、总胆固醇(total cholesterol，CHOL)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL-C)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL-C)用全自动生化仪测定。严格按照试剂盒说明书步骤测定。

1.7.3胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)HOMA-IR=(空腹血糖×空腹血清胰岛素)/22.5[3]。

1.8统计学方法

2　结果

2.1一般状态观察

正常组大鼠精神状态良好，反应灵敏，动作自如，皮毛有光泽。模型组以及给药组在喂养高脂饲料阶段，体重逐渐上升，出现精神萎靡，反应迟钝，动作迟缓，皮毛失去光泽的情况，造模结束给药后，模型组大鼠以上这些情况逐渐加重的同时尿量明显增多。吡格列酮组、仙鹤草高剂量治疗组有类似模型组表现，但程度较轻。在给药阶段模型组，吡格列酮组、仙鹤草高低剂量组分别死亡1只，推测原因可能是血糖突然升高，发生了酮症酸中毒(DKA)。在取材阶段，仙鹤草低剂量组由于取血失败，造成腹主动脉大出血致死。最后正常组、模型组、吡格列酮组、仙鹤草高剂量组进入统计的大鼠均为8只，仙鹤草组进入统计的大鼠7只。

2.2仙鹤草提取物对大鼠FBG,Fins,HOMA-IR的影响

模型组与正常组相比FBG升高(P=0.000,P<0.01)，吡格列酮组与模型组相比FBG下降(P=0.030,P<0.05)，仙鹤草高剂量组与模型组相比FBG降低(P=0.013,P<0.05)，说明仙鹤草可降低大鼠血糖；模型组与正常组相比Fins升高(P=0.000,P<0.01)，吡格列酮组与模型组相比Fins下降(P=0.030,P<0.05)，仙鹤草高剂量组与模型组相比Fins降低(P=0.048,P<0.05)，说明仙鹤草可降低血清中胰岛素的浓度；模型组与正常组相比HOMA-IR升高(P=0.000,P<0.01)，吡格列酮组与模型组相比HOMA-IR下降(P=0.006,P<0.01)，仙鹤草高剂量组与模型组相比HOMA-IR降低(P=0.006,P<0.01)，说明仙鹤草可缓解胰岛素抵抗。低剂量组有不同程度的改善，但差异无统计学意义。见表1。

表1　仙鹤草提取物对大鼠FBG,Fins,HOMA-IR的影响

注：与正常组相比，aP<0.01；与模型组相比，bP<0.05，cP<0.01。

表2　仙鹤草提取物对大鼠血脂的影响

注：与正常组相比，aP<0.01；与模型组相比，bP<0.05，cP<0.01。

2.3仙鹤草提取物对大鼠血脂水平的影响

模型组与正常组相比血清中TG含量升高(P=0.000，P<0.01)，血清中CHOL含量升高(P=0.000，P<0.01)，LDL-C含量升高(P=0.000，P<0.01)，HDL-C水平降低(P=0.001，P<0.01)。仙鹤草高剂量组与模型组相TG水平降低(P=0.010，P<0.05)，HDL-C水平升高(P=0.005，P<0.01)；吡格列酮组与模型组相比HDL-C水平升高(P=0.009，P<0.01)。见表2。

2.4仙鹤草提取物对大鼠血清炎性因子TNF-α、CRP的影响

模型组与正常组相比血清TNF-α高于正常组(P=0.000，P<0.01)，吡格列酮组与模型组相比TNF-α下降(P=0.029,P<0.05)，仙鹤草高剂量组与模型组相比TNF-α降低(P=0.001,P<0.01)，说明仙鹤草可降低血清TNF-α含量；模型组与正常组相比血清CRP高于正常组(P=0.000,P<0.01)，吡格列酮组与模型组相比CRP下降(P=0.001,P<0.01)，仙鹤草低剂量组与模型组相比CRP降低(P=0.024,P<0.05)仙鹤草高剂量组与模型组相比CRP降低(P=0.015,P<0.05)，说明仙鹤草可降低血清CRP含量。

表3　仙鹤草提取物对大鼠血清炎性 因子的影响

注：与正常组相比，aP<0.01；与模型组相比，bP<0.05，cP<0.01。

3　讨论

仙鹤草是良好的收敛止血药，传统多用于治疗各种出血症，而近年来临床上将其应用又扩大到抗糖尿病，抑菌，抗肿瘤，抗心律失常等疾病的治疗上，其中有关仙鹤草降血糖作用的临床报道引起了研究者的注意。范尚坦等人一直致力于仙鹤草治疗糖尿病的临床及实验研究，在临床经验的基础上，利用肾上腺素、四氧嘧啶诱导的糖尿病小白鼠动物模型验证了仙鹤草的潜在降糖作用，并推测其可能通过对胰岛素β细胞的保护作用，改善胰岛素的分泌缺陷，促进胰岛素β细胞分泌胰岛素起到降低血糖作用的[4-5]。现有实验研究所采用的实验动物模型多是采用化学损伤法复制的糖尿病动物模型，其造模原理为通过四氧嘧啶对胰岛β细胞高度选择的毒性作用，引发实验性糖尿病，此类模型多只符合1型糖尿病特征与2型糖尿病的病理特征相差较大，本研究采用于小剂量链脲佐菌素加膳食诱导法复制的更接近于2型糖尿病病理变化及临床症状的2型糖尿病大鼠模型观察仙鹤草对2型糖尿病的治疗作用，借此获得更可信、更有指导意义的实验数据[6-7]。

2型糖尿病患者约占糖尿病患者的90%左右，因此对2型糖尿病的防治已经成为了中国一个严重的社会公共问题。2型糖尿病常由胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能减退引起，是一种以双重病理机制(胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺乏)为特点的代谢性疾病。胰岛素抵抗是2型糖尿病的主要特征，不仅是其发生的驱动因素，而且贯穿于其病情发展的始终。大量的流行病学研究和临床研究显示慢性炎症反应是胰岛素抵抗的发生和发展中的重要环节[8]，而抗炎治疗可以改善患者糖、脂代谢异常，提高胰岛素敏感性。目前2型糖尿病胰岛素抵抗所涉及到的主要炎症因子包括：(1)急性期反应蛋白，主要由肝细胞产生，如C反应蛋白(CRP)、血清淀粉样蛋白A(SAA)等[9]；(2)细胞因子，如肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素-6等[10-13]。本实验以炎性因子TNF-α、CRP为切入点，初步探寻仙鹤草的作用机制。

本研究结果显示，小剂量链脲佐菌素加高脂饮食诱导的2型糖尿病模型大鼠显示出高血糖血脂异常，高胰岛素血症以及胰岛素敏感性降低，血清炎性因子TNF-α、CRP含量升高的特征，经高剂量的仙鹤草干预后，大鼠血糖降低，血清中胰岛素含量减少，血脂异常得以改善，并且胰岛素敏感性增加，血清炎性因子TNF-α、CRP含量降低。而仙鹤草低剂量组虽然可降低血清中炎性因子CRP含量，但是对于血糖等异常变化的改善作用并没有显现出有统计学的治疗意义。根据实验结果推断仙鹤草可改善2型糖尿病模型大鼠胰岛素抵抗状态，从降糖调脂两个方面起到抗糖尿病的作用，并且推断抗炎作用是其作用机制，但尚需更进一步从炎症反应方面对其作用机制进行具体研究，深层次的挖掘其分子作用机制。另外，本实验只是对仙鹤草粗提取物进行了研究，尚不明确仙鹤草抗2型糖尿病胰岛素抵抗作用的有效部位及活性成分，故对仙鹤草抗2型糖尿病胰岛素抵抗的作用机制进行多靶点的深层次研究的同时，筛选出作用的有效成分是日后研究的重点。

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