灯盏花素对大鼠胰腺缺血再灌注损伤的保护作用的实验研究

陈元岩，李天翔，谢明飞，石汉平，宋新民

(1.广州市中西医结合医院胃肠外科，广东 广州 510800；2.中山大学附属第一医院胃肠外科)

缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)损伤是指各种病理情况下组织器官缺血一段时间后重新恢复血流，损伤却进一步加重的现象[1]。能量代谢障碍、氧自由基的产生、细胞内钙超载、微循环功能障碍及中性粒细胞活化并释放炎性细胞因子为I/R损伤的主要发病机制[2]。近年来研究表明肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)是参与组织器官I/R损伤的重要细胞因子[3]，细胞凋亡[4]与组织器官I/R损伤有关。灯盏花主要分布于我国西南等省区，具有活血化瘀、改善微循环、通络活络、消炎止痛等功效[5]。本实验研究灯盏花素对大鼠胰腺I/R损伤时血清中TNF-α、IL-1β的变化水平及胰腺组织中Survivin蛋白表达的影响，探讨其在胰腺I/R中有无保护作用及其可能机制，为临床防治胰腺I/R损伤提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 远交群大鼠(SD大鼠)45只，由中山大学动物实验中心提供，合格证号：scxk(粤)20080020，体重(220±20)g，雌雄不拘。随机分为3组：假手术组(A组)、I/R组(B组)及灯盏花素组(C组)，各组大鼠15只，各组根据再灌注时间不同分为0、6、12 h三个时点，各时点大鼠5只，各组无死亡大鼠。

1.2 实验试剂 大鼠TNF-α、IL-1β免疫试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)，灯盏花素注射液(10 ml/支，批准文号Z20040033，云南省玉溪制药有限公司)，大鼠Survivin免疫组化试剂盒(美国Neomarkers公司)。

1.3 模型制备 所有实验鼠术前禁食12 h，自由饮水，3%戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉，固定后取腹正中切口入腹，A组在开腹显露腹腔干和肠系膜上动脉后不作阻断；B组开腹显露腹腔干和肠系膜上动脉，用无创血管夹阻断腹腔干和肠系膜上动脉30 min后松开动脉夹进行再灌注，于再灌注前10 min经尾静脉推注生理盐水5 ml/kg；C组按B组手术方法处理，于再灌注前10 min经尾静脉推注灯盏花素注射液4 mg/kg。操作过程中所有实验动物腹腔内注入37 ℃生理盐水0.5 ml/kg，以保持血流动力学稳定。

1.4 观察指标 各组实验动物在再灌注0、6、12 h时立即腹主动脉采集血标本约2 ml，2 000 r/min离心10 min，提取血清标本，采用ELIS A方法测定血清TNF-α、IL-1β；具体步骤按试剂盒说明书进行。切取胰腺体尾部组织约1.0 cm×1.0 cm大小，固定于10%甲醛液中，常规病理切片，用于HE染色和免疫组化实验。免疫组化采用SP染色法，具体步骤严格按试剂盒说明书进行，阳性片由美国Neomarkers公司提供，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。Survivin蛋白阳性染色细胞以细胞质为棕黄色，400倍光镜下观察，每片随机取5个视野，计算阳性与阴性细胞数，最后计算阳性百分率。细胞阳性染色≤10%为阴性表达，染色>10%为阳性表达。

2 结果

2.1 大鼠血清TNF-α、IL-1β水平的变化 在再灌注0、6、12 h时，B、C组血清中TNF-α、IL-1β含量均较A组显著升高(P<0.05)，但C组增高水平明显低于B组(P<0.05)，见表1。

表1 各组不同时点TNF-α和IL-1β含量比较

注：与A组比较：1)P<0.05；与B组比较：2)P<0.05

2.2 大鼠胰腺组织Survivin蛋白表达水平的变化 在再灌注0 h时，A、B、C三组胰腺组织Survivin蛋白表达水平比较组间差异无显著性；在再灌注 6 h、12 h时C组胰腺组织Survivin蛋白表达较A、B组明显增加(P<0.05)，但A、B两组间差异无显著性，见表2，图1-2。

表2 各组不同时点Survivin蛋白表达水平的比较

注：与A组比较：1)P<0.05；与B组比较：2)P<0.05

2.3 组织形态学改变 光镜下A、B组各时点未见明显组织形态学改变；B组在再灌注0 h时见毛细血管扩张充血，炎性细胞浸润；在再灌注6 h见灶状坏死、核溶解；在再灌注12 h见片状坏死。

图1 Survivin蛋白在再灌注6 h I/R组胰腺组织中的表达(SP染色×400)

图2 Survivin蛋白在再灌注6 h灯盏花素组胰腺组织中的表达(SP染色×400)

3 讨论

引起胰腺I/R损伤的疾病临床上常见于急性坏死性胰腺炎、肠系膜血管栓塞、胰腺移植、胰腺损伤以及休克等病理情况[6]。其发病机制复杂，其中最主要发病机制与能量代谢障碍、细胞内钙超载、氧自由基的生成增多及及中性粒细胞激活并释放炎性细胞因子等有关[7]。I/R时细胞内Na+-K+-腺嘌呤核苷三磷酸(Na+-K+-adenosine triphosphate，Na+-K+-ATP)酶活性降低，膜通透性增加，ATP产生减少，大量Ca2+进入细胞内，激活细胞膜上的蛋白酶和磷脂酶，破坏细胞膜的完整性，干扰线粒体的氧化磷酸化，导致能量代谢障碍，机体免疫功能受损，产生大量炎性细胞因子及氧自由基[8]，其中TNF-α和IL-1β是介导I/R损伤的主要细胞因子，本组实验结果显示：在再灌注0、6、12 h时，B组与C组TNF-α、IL-1β同A组相比明显升高(P<0.05)，提示胰腺I/R后，炎性细胞因子起着非常重要的作用。

细胞凋亡是指为维持机体内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。是一种不同于细胞坏死的生理性、主动性死亡，又称程序性细胞死亡[9]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成员，是目前发现的最强的凋亡抑制因子，该基因全长15 KB，定位于17q25，含有4个外显子和3个内含子，其编码产物为142个氨基酸组成的蛋白，分子量16.2 KD，可阻断因氧自由基、辐射、缺血缺氧、抗肿瘤药物等刺激引起的细胞凋亡[10]。

灯盏花素具有改善微循环，舒张血管，减低血管阻力，加快血流，红细胞解聚，明显降低血浆黏度、红细胞聚集指数及红细胞比容，增加血流量，改善局部供血，抑制血小板积聚等功能[11，12]。此外，研究发现灯盏花素有较强的蛋白激酶C抑制作用[13]，以及能抑制氧化应激和抑制细胞凋亡。从本实验的结果来看，C组TNF-α、IL-1β增加的程度明显低于B组(P<0.05)，同时组织病理学结果显示：C组病理学改变较B组明显减轻，说明灯盏花素在减轻大鼠胰腺I/R损伤方面有明显的保护作用；C组Survivin蛋白表达较A组和B组明显增加(P<0.05)，但A和B组之间差异无显著性(P>0.05)，表明灯盏花素可以上调I/R损伤时胰腺细胞Survivin蛋白的表达，抑制细胞凋亡。综上所述，灯盏花素对大鼠胰腺I/R损伤有保护作用，其机制可能上调Survivin蛋白表达有关，但其促使Survivin蛋白表达增强的具体机制尚不清楚，有待进一步研究。

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