柑橘采后腐烂主要致病菌的分离鉴定及丁香精油对其抑制作用研究

解淑慧　邵兴锋　王可　张兴龙　王鸿飞

摘 要：【目的】为了确定浙江宁海本地柑橘优势腐败菌及丁香精油对其的抑菌效果，【方法】从自然腐烂的柑橘上分离优势菌，采用传统真菌形态学鉴定方法结合rDNA-ITS序列分析方法进行鉴定，并采用体外试验研究丁香精油对优势菌的抑菌效果。【结果】结果表明，浙江宁海本地柑橘分离所得6株真菌分别为指状青霉（Penicillium digitatum）、柑橘链格孢（Alternaria citri）、枝孢样枝孢霉（Cladosporium cladosporioides）、 聚多曲霉〔Aspergillus sydowii）、近玫色锁掷孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）和卡利比克毕赤酵母（Pichia caribbica）；其中P. digitatum和C. cladosporioides是优势腐败菌；体外抑菌试验表明，丁香精油对P. digitatum和C. cladosporioides有较好的抑菌效果，抑制中浓度（EC50）分别为2.51 mL·L-1和0.57 mL·L-1；最小抑菌浓度（MIC）分别为6 mL·L-1和3 mL·L-1。【结论】丁香精油可以抑制柑橘采后主要病原菌的生长。

关键词： 柑橘； 优势菌； 分离鉴定； rDNA-ITS； 丁香精油

中图分类号：S666 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0134-06

浙江是全国柑橘的主要产地之一，但是在柑橘采后贮藏过程中，真菌引起的病害造成约10%的损失或者更高，带来了巨大的经济损失。国内外学者认为，指状青霉（Penicillium digitatum）和意大利青霉（Penicillium italicum）是引起柑橘采后腐烂的主要真菌[1]。对柑橘等果实采后主要致病菌的分离鉴定，是选择采后防腐保鲜方法的前提。

目前对真菌的鉴定主要采用传统形态学方法，该方法由于经验、时间等限制，在实践中有一定的困难。近年随着分子生物学的发展，分子手段被广泛地应用于真菌的分类鉴定，特别是rDNA- ITS 分子标记法。真菌rDNA的引物ITS1和ITS4适用于大多数担子菌和子囊菌的检测。而由于真菌核酸序列的rDNA在18s、28s区域具有保守性，在ITS区段又存在在属、种水平上的差异[2]。因此通过对ITS区进行扩增测序，来检测病原真菌的技术已越来越被广泛应用[3]。

丁香为桃金娘科植物丁香（Eugenia Cargophyllata Thunb） 的干燥花蕾，是我国的传统中药。丁香精油含有丁香酚、乙酰丁香酚、丁香烯等成分，对葡萄灰霉菌、链格孢、桔青霉等多种病原菌具有较强的抑制作用[4-7]。有研究表明丁香精油对苹果的采后贮藏有明显的保鲜效果[8]， 但丁香精油在柑橘防腐保鲜上的研究鲜见报道。

我们拟从浙江宁海本地产柑橘上分离优势菌，采用传统真菌形态学分类鉴定结合rDNA- ITS 分子标记法对所分离到的菌株进行鉴定，以确定地产柑橘的优势腐败菌；同时，进一步分析丁香精油对柑橘主要优势腐败菌的抑制效果，以期望将丁香精油这一绿色防腐保鲜方法应用于柑橘采后病害的防治。

1 材料和方法

1.1 材料

柑橘品种为早熟宫川，选择浙江宁海柑橘果园树上自然发病和采后贮藏过程中自然腐烂的果实。丁香精油纯度95%以上，购自成都科帝亚试剂有限公司。

1.2 柑橘采后优势菌的分离

从自然发病的柑橘果实病健处切取果皮组织，用75%的医用酒精消毒1 min，无菌水冲洗下孢子接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA），25 ℃培养[9]。经多次划线分离得纯种菌株。

1.3 菌株致病性检测

将纯化培养的菌株用无菌水配制成菌悬液，调至105个·mL-1。将柑橘果实用2%次氯酸钠溶液消毒2 min，清水洗净，用消毒接种针在柑橘果实赤道处刺一个直径3 mm、深3 mm的伤口，在伤口处分别接种20 μL孢子悬浮液，晾干，于25 ℃培养观察果实发病情况。根据柯赫氏法则，检测菌株的致病性。

1.4 菌株传统形态学观察

将培养7 d的菌落，挑取边缘菌丝放在滴有乳酸石炭酸棉蓝染色液的载玻片上，置于显微镜下观察[10]。

1.5 菌株rDNA-ITS 序列分析

1.5.1 DNA的提取 将纯化所得的6株菌接种于马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB），25 ℃、140 r·min-1培养3 d后，6000 r·min-1离心10 min，取少量菌丝，用真菌基因组DNA快速抽提试剂盒（上海生工生物有限公司）提取DNA，按说明书操作。

1.5.2 基因序列的测定 采用通用引物 ITS1 （5- TCCGTAGGTGAACCTGCGG- 3） 与 ITS4 （5- TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3） 进行PCR扩增。PCR反应体系：dNTP 4 μL，10×PCR buffer 5 μL（含15 mmol·L-1镁离子），引物各1 μL，Taq酶 0.5 μL，模板DNA1 μL，用dd H2O补至50 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s， 54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30个循环，72 ℃终延伸10 min。将PCR扩增产物直接送往上海生工生物有限公司进行DNA测序。

1.5.3 同源性分析 将测序结果进行BLAST比对，利用MEGA软件对测序所得序列及GeneBank中选取的参比菌株的18S rDNA基因序列进行同源性分析，构建系统发育树[11-12]。

1.6 丁香精油对P. digitatum和C. cladosporioides的抑菌效果

根据致病性检测结果选取P. digitatum和C. cladosporioides 2株菌进行丁香精油抑菌效果的研究。用含1%（v/v）吐温-80的无菌水将丁香精油分别稀释为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0 mL·L-1。参考杨红等[13]的方法，无菌条件下，向培养皿里倒入9 mL 50 ℃左右的PDA培养基，加入1 mL不同浓度的精油溶液，混匀，制得含丁香精油平板。待培养基凝固后，用直径5 mm的无菌打孔器在生长3 d的菌落边缘切取菌饼，接种至含丁香精油PDA培养基中心，于25 ℃恒温培养5 d，以不含丁香精油培养基生长的菌落作对照，测量空白组和处理组菌丝直径，计算丁香精油对P. digitatum和C. cladosporioides菌丝生长的抑制百分率，以生长过程中无菌丝生长的最低浓度为最小抑菌浓度（MIC）。每种处理5个平行，重复3次，取其平均值。

根据不同配比的抑制率，将抑制率换算成几率值（y），药剂体积分数（mL·L-1）换成对数值（x），建立毒力回归方程（y=b+ax），计算出对病原菌的抑制中浓度（ EC50） 。

菌丝抑制率（%）=（对照组菌落直径-处理组菌落直径）/（对照组菌落直径-菌饼直径）×100。

1.7 数据分析

采用EXCEL 2003软件进行数据统计，所有数据均为3次重复实验的平均值。并利用MEGA 4.1对基因序列作图分析。

2 结果与分析

2.1 优势菌的分离及形态学观察

从宁波本地自然腐烂的柑橘果实上共分离出6株菌，分别记为A、B、C、D、E、F。菌株A在PDA培养基上菌落呈绒状，圆形，基本上无气生菌丝；菌丝开始为白色，逐渐变为青绿色；基质颜色为白色。显微镜观察其菌丝顶端具有1～3 个分枝，扫帚状；有分生孢子梗和分生孢子，且分生孢子无色，近球形（图版-A）。

菌株B在PDA上的菌落边缘不整齐，菌丝较长，初期为灰白色，逐渐长满平皿，最终转为灰褐色至黑色。镜检显示分生孢子大都呈卵形，暗褐色，菌丝体不分枝，具隔膜（图版-B）。

菌株C在PDA上菌落成绒状，绿色，基质颜色由绿色变为黑灰色；镜检观察菌丝体不分枝，具隔膜，分生孢子为卵形（图版-C）。

菌株D在PDA培养基上菌落呈粉粒状，菌落较小边缘清晰，菌丝体为墨绿色；镜检显示分生孢子梗末端膨大成圆形，产生分生孢子（图版-D）。

菌株E在PDA上菌落生长较快，呈液体状，粉红色，无菌丝。镜检观察其菌体成卵圆形，分裂生殖（图版-E）。

菌株F在PDA上菌落生长较快，菌落小且为白色，呈凸起状，有特殊气味。镜检观察菌体为圆形（图版-F）。

根据形态特征及镜检结果， 参照魏景超[14]的真菌鉴定手册，初步判定的结果为： A为半知菌亚门青霉属，B为半知菌亚门链格孢属，C为半知菌亚门枝孢霉属，D为半知菌亚门曲霉属，E为担子菌亚门锁掷孢酵母属，F为子囊菌亚门毕赤氏酵母属。

2.2 菌株的致病性检测

A菌株接种在柑橘果实后，1 d后开始发病，在果皮表面起始为水渍状，之后快速形成白色菌丝，在果皮表面迅速扩展，最后形成青绿色霉层。B菌株在柑橘表面形成干疤，病斑褐色，通常为圆型。C菌株侵染柑橘果实后，首先在表皮长出白色菌丝，接种3天后完全形成墨绿色霉层。D菌株在果皮及内部形成病斑，开始为深褐色水渍状病斑，逐渐长出白色菌丝，其后上生出大量的分生孢子最后形成墨绿色霉层。E菌株接种到柑橘果实后，果实未见明显变化，7 d后伤口结疤。F菌株接种柑橘果实后，未见明显发病症状。初步断定A、B、C、D为柑橘采后病原菌，且A、C为导致柑橘腐烂的主要致病菌；E、F可能为酵母菌。

2.3 菌株rDNA-ITS 序列分析

将测序结果与GenBank 上已登录的基因序列进行比对，选取相近的参考菌株，利用MEGA4. 1 软件基于18S rDNA 序列采用NJ法构建系统发育树，确定其进化地位，结果如图1所示。

从系统发育树来看，A与P. digitatum亲缘关系较近，与 GenBank 中的基因序列比对后，A与P. digitatum的相似性为99%，因此，初步将A鉴定为P. digitatum。B与Alternaria citri在亲缘关系上最近，经 GeneBank 中比对，基因序列相似性高达为99%，将B在分类学地位上归于A. citri。C、D分别与C. cladosporioides和A. sydowii 聚在一起，亲缘关系较近，可将其归为C. cladosporioides和A. sydowii。E、F与S. pararoseus和P. caribbica的遗传距离最近，在 GeneBank 中比对，相似性也分别达到99%和100%，因此，将其分别归为S. pararoseus和P. caribbica。

结合传统形态学特征，综合鉴定结果为：A为指状青霉P. digitatum，B为柑橘链格孢A. citri，C为枝孢样枝孢霉C. cladosporioides，D为聚多曲霉A. sydowii，E为近玫色锁掷孢酵母S. pararoseus，F为卡利比克毕赤酵母P. caribbica。

2.4 丁香精油对P. digitatum和C. cladosporioides的抑制中浓度（EC50）和最小抑制浓度（MIC）

从表1可以看出，丁香精油对P. digitatum有一定的抑制效果，且随着丁香精油浓度的增加而增加。当浓度为6 mL·L-1时，菌丝延伸量为0，此时为丁香精油对P. digitatum的最小抑制浓度（MIC）。通过计算各处理组的菌丝抑制率，建立毒力回归方程为y=0.815 9x+1.045 1（R2=0.964 2），根据方程，计算出丁香精油对P. digitatum的抑制中浓度（EC50）为2.15 mL·L-1。

从表2可知，丁香精油对C. cladosporioides的抑制效果随着浓度的增加而增加，其对C. cladosporioides的MIC为3 mL·L-1。计算各处理组的菌丝抑制率，建立毒力回归方程为y=0.8159x+1.0451（R2=0.9642），得出丁香精油对C. cladosporioides的EC50为0.57 mL·L-1。结合两表可以看出，丁香精油对P. digitatum和C. cladosporioides的抑制效果不同，尤其对C. cladosporioides的抑制效果更佳。

3 讨 论

由于rDNA- ITS 是介于5.8S rDNA、18S rDNA和28S rDNA 之间的区域，有研究表明ITS在真菌种内不同菌株间高度保守可以为真菌的系统分类提供相应的遗传信息。而多数真菌菌落外观不易描述，且其显微结构和菌落形态也会受到培养基等因素的影响发生不同或变异，单纯依据传统形态学进行分类，结果不可靠。所以，现代分子学手段已发展应用在检测真菌病害或鉴定系统的领域内[15-16]。本试验结果表明，传统形态学可将菌株鉴定到属，结合了rDNA- ITS分子标记法，能将菌株鉴定到种的水平上。综合所得，浙江宁海本地产柑橘采后主要致病菌为P. digitatum、A. citri、C. cladosporioides、A. sydowii。虽然国内外学者普遍认为意大利青霉（P. italicum） 与指状青霉（P. digitatum）是引起柑橘采后腐烂的主要致病菌，也有文献[17]证实柑橘链格孢（A.citri）为柑橘致病菌，然而，可能由于产地、品种、管理条件、气候等的不同，导致引起柑橘采后腐烂的致病菌发生了变化。

从柑橘上分离所得的卡利比克毕赤酵母（P. caribbica）在柑橘致病性检测试验中柑橘在10 d后病斑与P. digitatum引起的病斑极相似，因此应为柑橘发病中后期的病害拮抗菌，在短时间内对致病菌有拮抗作用。有研究表明许多酵母菌对果蔬采后的病害具有抑制作用，酵母能够产生葡聚糖酶、几丁质酶等孢外水解酶可以分解病原菌的细胞壁或菌丝体从而破坏病原菌的生长代谢[18]。研究比较广泛的拮抗酵母菌有隐球酵母属、毕赤氏酵母属、假丝酵母属等，其中毕赤氏酵母属对柑橘[19]、樱桃[20]、葡萄[21]等采后病害有明显抑制效果，并且已应用于商业生产。而分离所得的近玫色锁掷孢酵母（S. pararoseus）相关研究报道较少，是否为拮抗酵母有待于进一步研究。

通过培养基加药法研究了丁香精油对P. digitatum和C. cladosporioides的抑制效果。试验表明，丁香精油对这两株菌有不同程度的抑制效果，由于不同菌种之间对丁香精油的耐受程度不同，所表现出来的抑制效果也不同。丁香精油的主要成分为丁香酚，含量高达60%。而植物精油一般作用于脂质膜[22]，丁香酚与细胞膜中的磷脂发生反应，影响膜的结构，改变细胞膜的通透性，导致生物体内离子泄露，并且引起胞内损伤从而抑制微生物的生长。目前对于植物精油的抑菌机理主要集中在细胞壁、膜的影响上，其更深层次的机理在今后仍需进一步的研究。

4 结 论

结合传统的形态学方法和rDNA- ITS分子标记法分析浙江宁海本地柑橘采后致病菌，同时研究丁香精油对主要致病菌的抑制作用。研究结果表明，柑橘上分离得到指状青霉（P. digitatum）、柑橘链格孢菌（A. citri）、枝孢样枝孢霉（C. cladosporioides）和聚多曲霉（A. sydowii）这4种致病菌；其中，优势腐败菌为P. digitatum和C. cladosporioides。同时，分离出近玫色锁掷孢酵母（S. pararoseus）和卡利比克毕赤酵母（P. caribbica）；丁香精油对P. digitatum和C. cladosporioides有较好的抑菌效果，抑制中浓度（EC50）分别为2.51 mL·L-1和0.57 mL·L-1；最小抑菌浓度（MIC）分别为6 mL·L-1和3 mL·L-1。说明丁香精油可以成为一种新的柑橘采后防腐保鲜方法，具有较大的商业应用前景。（本文图版见插1）

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