原生动物群落调查及水质评价方法研究综述

孙志强，施心路，2，3，刘桂杰，3，齐桂兰，孟祥玮

（1．杭州师范大学动物适应与进化杭州市重中之重实验室，浙江杭州310036；2．中国海洋大学原生动物学研究室，山东青岛266003；3．中国科学院水生生物研究所，淡水生态与生物技术国家重点实验室，湖北武汉430072；4．聊城大学生命科学学院，山东聊城252059）

目前我国淡水资源严重短缺，人均占有量仅为世界平均水平的四分之一，并且水质污染现象日趋严重，各主要水系及河流均受到不同程度的污染，所以对水环境的保护及监测工作显得尤为重要［1］．

近年来兴起的生物监测技术在自然及人工水体监测中的应用已取得了可喜的成果，其评价及监测结果可以直接反映水体的健康状况，其中原生动物在水质监测中的优势尤为突出［2－5］．前人关于原生动物在水质监测中的作用及功能的综述较为多见［4，6］，但针对具体的实验方法、操作中要注意的问题以及分析方法的介绍则相对较少，至今，用于原生动物评价水质的确切方法仍然在不断改进．本文旨在总结前人的做法，综合各学者的改进，为后来者开展实验研究提供参考．

1 原生动物简介

原生动物是一类最原始、最低等的单细胞动物，每个细胞就是一个完整的生命体，其细胞内特化的各种细胞器通常就可完成运动、营养、呼吸、排泄和生殖等一系列的生理生化活动［6］．它们种类繁多，分布甚广且数量大，因而在生态系统特别是水域生态系统中担任着极为重要的角色［4］．

水质监测中经常利用的原生动物总体上可分为3大类［4，6－7］：（1）鞭毛虫（Mastigophora），主要包括植鞭毛虫（Phytomastigophorea）和动鞭毛虫（Zoomastigophorea）．植鞭毛虫也被植物学家们称为鞭毛藻（Flagellata）．（2）纤毛虫（Ciliata），它们是原生动物中特化程度最高、最为复杂、个体最大且数量最多的一大类群，具有典型的特征，目前有很多以纤毛虫为对象来探讨生物与水质关系的研究［3，8－9］．（3）肉足虫（Sarcodina），环境中常见的有砂壳虫属（Difflugia）、表壳虫属（Arcella）的种类．

大量研究表明，水域环境条件的突然改变将对该环境中生活的原生动物群落结构产生直接的影响，从而影响水体的质量．当水体中出现污染冲击时，无论是重金属还是有机污染，原生动物群落的稳定性就会遭到破坏，直接表现就是种类减少、多样性指数降低［10］．因此，可以利用原生动物群落特征来监测与评价水质．

2 实验方法概述

2．1 样点设置

根据不同的调查目的有相应的设置原则［11］：（1）时间分布，如研究一年四季或12个月的原生动物分布．原生动物在不同的季节会有不同的分布特征，表现在种类、丰度等各方面，一般来说纤毛虫在春秋季较多，冬夏季较少．设置样点时应尽可能考虑到该水域的平均状况，分散设置．许恒龙、姜勇等［12－13］在胶州湾，陈立婧等［14］在上海明珠湖都做过相关研究，发现原生动物群落具有明显的季节性．（2）水平分布，即不同空间位置的原生动物分布特征．根据空间差异，如在不同的污染带、河流交叉口、环境因子差异明显的位点等，这方面研究比较多，常用于水质监测等．如郑金秀等［15］在长江上游分为3段采样，讨论了河流地理特征及三峡蓄水等因素对原生动物群落的影响；许木启等［16］在汉沽稳定塘从入水口到出水口依次设5个样点，根据原生动物群落变化探讨稳定塘的净化效能，发现随着水质的净化原生动物群落也在相应变化，与水质变化的情况相吻合；韩蕾等［17］、陈红等［18］的研究都表明在不同的水域有着不同的原生动物群落特征．（3）垂直分布，多见于较深的河流或湖泊，在不同水层分别采样，观察不同水深的原生动物分布特征，还常结合季节迁移或昼夜迁移等．如对Kaštela Bay（central Adriatic Sea）［19］的纤毛虫季节分布与垂直分布的研究．

2．2 采样方法

浮游生物的采样方法主要有3种，分别是浮游生物网法、采水器法和PFU（Polyurethane Foam Unit）法，固着类还有载玻片法等［3，20］．浮游生物网常见的有25号、20号和13号3种规格，网孔大小分别为64 μm（200孔／in，1in＝2．54cm）、76μm（193孔／in）和112μm（130孔／in）．定性样品通常用25号筛绢制成的浮游生物网（网目64μm）拖捞获取，用50mL5%福尔马林固定［14－15］．定量样品用1L或2．5L的采水器分别将采自各层（通常上中下3层）的水样混合均匀（如研究垂直分布则另当别论；水深超过20m则只取变温层［11］），取1L装入容器中，现场以1%的比例加入鲁哥氏液（Lugol’s Iodine solution）固定［2，14，21］，或以2%的比例加入［3，12］，固定效果也许更好．

PFU法是由Cairns等于1969年创建，沈韫芬在20世纪80年代初引入中国并加以完善，成为微型生物监测的先进方法［4，10，22］．由于其操作简单、可靠性强、重复性好、对比度大等优点，近年来得到了广泛的应用，并发展成为我国水质监测的国家标准［10，23］．该方法主要根据岛屿生物地理学理论，利用聚氨酯泡沫塑料块（Polyurethane Foam Unit）方法测定微型生物的群集速度，最后得出3个功能参数：Seq为平衡时的种数，G为群集曲线的斜率（也可称群集速度常数），T90%为达到90%Seq所需要的时间．利用微型生物在PFU上群集过程中3个参数的变化，可以评价水质和监测水污染［4，10，24－25］．

近年来有人提出了改良的方法，在外边套上一个露底的塑料瓶，这样就可以抗击风浪的冲击，成为改良的PFU，称BPFU［26］，也取得了不错的效果．

2．3 样品处理及鉴定计数

将固定好的样品带回实验室静置48h，使生物充分沉淀，然后用虹吸管将上清液慢慢吸走（一般吸走980mL上清液需要20～30min），并且最好用25号筛绢扎在管口，以防样品中生物流失，最终浓缩至30～50mL为宜，加1mL 4%的福尔马林溶液，以便长期保存［14，20］．也可以直接用20μm筛绢过滤［13］，同样可以达到浓缩的目的．镜检时，先轻轻摇匀样品，用移液枪吸取0．1mL于0．1mL计数框中，静置1～2 min后在显微镜下全片计数，取两片结果的平均值，以如下公式计算个体密度：N＝（Vs×n）／（V×Va）．式中，N：个体密度（ind．／L）；V：采样体积（L）；Vs：沉淀体积（mL）；Va：计数体积（mL）；n：计数所得个体数．

生物量一般采用体积估算法，按照密度为1g／cm3来计算［11，14］．物种鉴定主要依据形态学特征，比对相关图谱、照片或视频，活体观察，有时还要染色制片或利用分子方法，综合鉴定得出结论．图谱常用的有《原生动物学》［27］、《微型生物监测新技术》［7］、《中国黄渤海的自由生纤毛虫》［28］、《淡水浮游生物研究方法》［11］、Free－livingFreshwaterProtozoa，AColourGuide［29］和《废水生物处理微型动物图志》［30］等．

3 结果分析

3．1 物种组成及丰度变化

在物种鉴定及计数的基础上对其进行分类研究，包括种类数和丰度．研究原生动物者，可将其分为鞭毛虫、纤毛虫和肉足虫，分析它们各自所占的比例，探讨原生动物组成及对水质的反映［13－14］；以纤毛虫为研究对象则又下分为动基片纲（Kinetofragminophorea）、寡膜纲（Oligohymenophorea）和多膜纲（Polyhymenophorea），或直接分为下毛目（Hypotrichida）、前口目（Prostomatida）、侧口目（Pleurostomatida）、膜口目（Hymenostomatida）、缘毛目（Peritrichida）等［3，8－9］；也有研究者只把肉足虫和纤毛虫看做是原生动物，如胡菊香等［31］对巢湖原生动物的研究，呼光富等［21］对武汉南湖原生动物的初步研究．植鞭毛虫的比例也常被作为水体富营养化的指标而利用［14］．

3．2 优势种

根据公式Y＝（Ni／N）fi计算物种的优势度，式中Ni为第i种的个体数，N为样品中所有种类的总个体数，fi为第i种的出现频率，Y＞0．02为优势种［14，20］．在正常情况下，群落的结构相对稳定，当受到环境胁迫如水体受到污染时，群落中的敏感种类减少，而耐污种类的个体数则大大增加，从而导致群落结构发生变化；温度、光照、流速等因素也会导致群落变化．不同的优势种反映的环境状况也不同，从而达到监测的目的［3，14］．如郑金秀［15］对长江上游原生动物的群落研究发现，随着水库蓄水，原生动物群落结构发生着变化，其优势种越来越不明显，库区的原生动物向多类型发展，说明水环境的稳定有利于原生动物多样性的发展．宋碧玉［32］在长江洞庭湖调查原生动物种群时发现，优势种类基本上属于a－β中污性种类，而理化分析结果也表明该河段水质为Ⅱ级．可见优势种可以在一定程度上反映水体所处的状态．

3．3 污染指示种

指示种又叫生物指示物（biological indicator），是根据Kolkwitz和Marrson在1909年首次提出污染系统和河流不同污染带（寡污带、α－中污带、β－中污带、多污带）的指示生物种类发展而来的［7］．王家楫等［30］的《废水生物处理微型动物图志》也对污染指示种进行了描述，沈韫芬等在《微型生物监测新技术》［7］一书中综合国内外的研究结果列出了4个污染带的198种原生动物污染指示种，可作为划分的参考．

多污性水体中的原生动物指示种有施氏肾形虫（Colpodasteinii）、闪瞬目虫（Glaucomascintillans）、梨形四膜虫（Tetrahymenapyriformis）、小口钟虫（Vorticellamicrostoma）等；α－中污性水体中有草履唇滴虫（Chilomonasparamecium）、卵形隐滴虫（Cryptomonasovara）、螅状独缩虫（Carchesiumpolypinum）、僧帽斜管虫（Chilodonellacucullulus）、僧帽肾形虫（Colpodacucullus）、尾草履虫（Paramecium cauatum）、普通表壳虫（Arcellavulgaris）等；β－中污性水体中如红球虫（Haematococcuspluvialis）、衣滴虫（Chlamydomonasmonadina）、三刺榴弹虫（Colepshirtus）、双环栉毛虫（Didiniumnasutum）、天鹅长吻虫（Lacrymariaolor）、大变形虫（Amoebaproteus）等；寡污性水体中如鹅长颈虫（Dileptusanser）、钟形钟虫（Vorticellacampanula）、截形平鞘虫（Platycolatruncata）等［30］．

许木启等［16］在汉沽稳定塘2号采样站所发现的波豆虫（Bodo）、眼虫（Euglena）和滴虫（Monas）均为耐污很强的鞭毛虫类；3号采样站仍以耐污的鞭毛虫和肉足虫为主；4号和5号两个采样站种类结构发生了变化，纤毛虫种类占据优势．理化指标显示从1号到5号水质逐渐变好，1号最差，没有发现原生动物．在对上海明珠湖［14］、长江洞庭湖口［32］的研究中也都用到了原生动物污染指示种，取得了满意的成果．使用时应注意，不能简单地以有或没有来判定水质的情况，应结合不同污染带指示种类数的多少及优势种的指示性等来综合评价［7］．

3．4 原生动物的功能类群

Pratt等［33］曾对美国6个湿地和一条河流中原生动物群落进行研究，并按照食性将原生动物分为6个功能类群，分别是：光合自养者P、食菌屑者B、食藻者A、腐生者S、杂食者N、捕食者R．干净的水体自养程度高，随着水质的污染，异养程度就会增加．若群落中P组和A组占比例大，说明水质较好；若S组和B组比例较大，说明水质较差［4，14］．对原生动物功能划分多参照《微型生物监测新技术》［7］一书．宋碧玉［32］在对长江洞庭湖口研究时发现食菌—碎屑者、食藻—细菌者多而光合自养者少，表明水体中悬浮颗粒和细菌较多，已有一定程度的有机污染，捕食者类群少预示着该处的有机污染尚不很严重．此方法还在众多研究中得到了应用，如长江上游［15］和汉江汉中段［9］等，都取得了不错的效果．

3．5 生物指数

多样性指数可以反映群落的结构特征，种的多样性包括两方面的内容：种类数的增减和每种类个体数的数量分布［20］．理想的状态是种类数多，每一种的个体数又相对较少，达到一种均衡的分布．人们应用数理统计的方法，求得多样性指数来综合表示生物群落的种类数和个体数，这在生态学研究中经常会被用到［14，16－18，20，34］．常用的指数如：（1）Margalef多样性指数（d）或称丰富度（richness）．d＝（S－1）／lnN，d值越大表示越清洁．0～1为重度污染，1～2为严重污染，2～4为中度污染，4～6为轻度污染，大于6为清洁水体［34］．（2）Shannon－Weiner多样性指数（H）或称多样性（species diversity）．，值为0～1时说明水体受到严重污染，1～2时为中等污染，2～3时为轻度污染，大于3为清洁水体［20］．（3）Simpon多样性指数（D）．D＝，也有用公式或其他表示．（4）均匀度evenness（J）．J＝H／lnS．（5）其他指数，如种类污染值（Species Pollution Value，SPV）、群落污染值（Community Polution Value，CPV）［35］以及Pantle计算的污生指数（Saprobic Index，SI）［9］等也可以很好地监测水质．式中S为物种数；ni为第i种的个体数；N为总个体数．如在汉沽稳定塘［16］中，随着水质的逐步改善，原生动物Margalef多样性指数d也稳步上升，从1号样到5号样分别为0、0．26、1．85、4．18、5．4．

近几年有些学者研究浮游生物水质评价时发现，多样性指数有时不能较好地反映水体的营养水平、水质的现状及变化趋势，特别是针对富营养化的水体，这种情况更明显［36－37］，有时也会因为pH、水温及流速等因素而产生影响［37］．

3．6 理化指标分析

研究水体中原生动物群落特征通常要和水质的理化指标相结合，来探讨生物与环境间的复杂关系［10，16］．水质测定主要依据国家环保总局主编的《水和废水监测分析方法》［8，9，34，38］或StandardMethods fortheExaminationofWaterandWastewater［3，12，39］等．主要指标包括：温度（T）、pH、溶解氧（DO）、生化需氧量（BOD）、化学需氧量（COD）、总氮（TN）、总磷（TP）、无机氮（DIN）、无机磷（DIP）、氨态氮（NH3－N）、硝态氮（NO3－N）、亚硝态氮（NO2－N）、可溶性活性磷酸盐（SRP）、叶绿素a（Chl a）、重金属、透明度（SD）和固体悬浮物（SS）等，可以根据研究需要，选取其中几种测定即可［2，5，8－10，12－14，38，40］．河流和湖泊通常会受到有机污染和重金属污染，有机污染主要指BOD、COD，特别是氮和磷浓度的增加，引发藻类的大量增长，从而影响原生动物群落的结构［7，13，16］．同时，与水体中原生动物的分布、现存量与温度、pH、溶解氧等生态限制因子有关［7，14］．

3．7 统计分析

除了利用生物学的方法对原生动物特征进行描述、归类及指数计算外，有时还需要利用统计学的方法对数据进行深度分析，以求更科学清晰地说明原生动物群落与水质的关系．常用的方法如：用t－检验或方差分析揭示不同样点或时间的数据差异，包括生物和理化数据；用聚类分析（Cluster Analysis）按照一定原则将数据归类，揭示数据间的联系及区别；用多维尺度分析（Multi－dimension Analysis，MDS）表示研究对象间的距离远近；用主成分分析（Principal Component Analysis，CAP）对变量进行归类、探讨；用相关性分析（Correlation Analysis）来表示生物数据与环境数据间的相关关系等．所用的统计软件有Excel、SPSS、SAS、Origin、statistics、primer等［2，3，12－14，25，41－42］．如许恒龙等在青岛胶州湾所做的在属的水平上对纤毛虫群落分布与水质关系的研究中，用聚类分析依据各属在各样点出现频率把属归为6类，说明了属的分布特点；分别用聚类分析和多为尺度分析依据生物数据对各样点进行归类，结果一致，同样依据理化数据分类，结果与生物数据的分类也保持一致，充分说明了胶州湾纤毛虫分布的样点差异，且与水质差异保持高度一致性；还用到了主成分分析和多元相关性分析，表明生物数据和理化指标间存在着密切的联系［43］．

4 问题及展望

经过多年发展，利用原生动物进行水质监测的技术日趋成熟，在国内外得到了广泛应用，已逐步发展成为一种标准可行的监测方法．就研究过程笔者提出几点问题：

（1）实验方法的规范性．在实验操作中，经常会出现结果因人而异的情况，可能跟研究者操作规范性和经验有关，特别是在物种鉴定中，差异有时会很大．所以研究者应加强学习，熟练掌握实验方法，做到规范操作．并在物种鉴定时采用可靠的资料为参照依据，有条件者可提供优势种、特有种的照片资料．

（2）研究方法的创新．研究方法如指示种、功能类群、群落结构、各种生物指数及统计学分析，都在不断发展，因此方法得当与创新至关重要．

（3）加强各种生物间的联系．研究原生动物要注重和藻类、轮虫、枝角类和桡足类等的联系，分析它们之间的关系，以便对水质现状做出更加系统而准确的评价．

（4）监测的目的在于保护．学者的努力不只是为了科学研究，更要提醒人们注重环境保护，提高人们保护水资源的意识，做到水资源的可持续利用．

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