骨骼肌纤维类型转换的分子信号机制

张 凯，高 原，苏艳红

骨骼肌是人体运动的动力系统，其性能对人体的运动能力具有至关重要的作用。不同的骨骼肌纤维类型在收缩力量、收缩速度以及抗疲劳能力等方面也会有明显差异。根据其收缩特性的不同，一般可分为快肌和慢肌两种类型，这种分类在一定程度上取决于不同类型肌球蛋白重链(Myosin heavy chain，MHC)的基因表达。成年哺乳动物骨骼肌有MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱa、MHC-Ⅱb、MHC-Ⅱx四种肌球蛋白重链异形体。由于MHC能够被多种因素调控，因此MHC的蛋白表达具有高度的可塑性。这些影响因素包括胚胎发育、神经支配、激素、活动或制动等[1]。不同的刺激因素会对骨骼肌的特性和组成产生不同的影响。但无论哪种刺激导致的骨骼肌纤维类型的变化，最终都会体现在不同MHC类型的特异性表达上，这种特异性表达受控于各种分子信号通路。

1 钙调神经磷酸酶信号通路

钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)是目前所知的唯一依赖于Ca2+/钙调素(calmodulin,CaM)的丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸。70年代末80年代初由加拿大籍华人王学荆教授、美国的Klee教授和美籍华人张槐耀教授的实验室分别在猪脑中发现并纯化成功，由于它结合CaM并且在动物神经元中大量存在，Klee将其命名为Calcineurin。CaN是由催化亚基(calmodulin-binding catalytic A subunit，CnA)和调节亚基(calcium-binding regulatory B subunit，CnB)组成的异型二聚体，几乎在所有的组织均有分布[2]。CnA作为全酶催化的核心，其活性受到CnB和CaM的激活，Ca2+通过钙调素和CnB实现对CaN的调节。CnA氨基端有一个催化域，中间是CnB和CaM结合域，羧基端有一个自抑制域。无刺激状态时自抑制域形成α螺旋封闭酶的底物结合区域，该酶处于失活状态；在刺激因素作用下，Ca2+/CaM结合到相应的结合位点，抑制域形状发生改变暴露活化位点，继而引起一系列的变构反应，该酶即变成激活状态[3]。它在肌纤维类型转变和骨骼肌肥大、心肌肥大、线粒体生物合成、氧化磷酸化、糖代谢、脂肪酸氧化、神经元重塑等过程中都有重要作用[4]。

1.1 钙调神经磷酸酶信号通路的调节机制

钙调神经磷酸酶信号转导调节机制被认为是骨骼肌纤维类型转换的重要途径。Chin等根据成肌细胞培养的研究结果提出：骨骼肌纤维类型基因表达受钙调神经磷酸酶信号通路的控制[5]。运动神经元引发肌纤维动作电位，激发肌细胞内钙离子浓度持续性升高，进而激活钙调神经磷酸酶，使活化的T细胞核转录因子( nuclear factor of activated t cells, NFAT ) 去磷酸化，去磷酸化的NFAT从胞浆转移至细胞核，结合到相应的核苷酸识别序列，引发目标基因的转录[6]。快慢肌各自所受的神经支配不同：在慢肌纤维中，神经冲动引起细胞质中钙离子长期持续的低振幅变化，这种变化能够激活CaN，使NFAT去磷酸化入核，调节慢肌纤维基因的表达；在快肌纤维中，神经冲动引起细胞质中钙离子短期持续的高振幅变化，这种变化不足以使CaN处于激活状态，也就不能使NFAT去磷酸化入核，失去对快肌纤维基因表达的调控。Chin等发现钙调神经磷酸酶不仅仅调控NFAT这一种转录调控因子，同时还调节其它因子，例如肌细胞提升因子-2(Myocyte Enhancer Factor-2，MEF-2)等[5]。

1.2 运动及外界刺激对钙调神经磷酸酶信号通路的影响

Serrano等通过建立大白鼠骨骼肌再生模型，运用环孢素A(CsA)和免疫抑制剂FK506来抑制CaN活性以及转基因的方法，发现在比目鱼肌再生过程的初期，MHC-Ⅱa表达增加，MHC-Ⅱx 和MHC-Ⅱb表达减少[7]。Delling等通过肌肉组织培养以及细胞转染实验，证明了该信号通路确实参与了骨骼肌的分化和MHC-Ⅰ的表达[8]。Parsons等通过敲除鼠钙调神经磷酸酶基因的实验研究发现，钙调神经磷酸酶能通过激活转录因子MEF-2和MyoD，影响肌球蛋白生成和骨骼肌分化，并且在建立的小鼠超负荷模型中，用CsA抑制钙调神经磷酸酶，就能抑制或阻断慢肌纤维的转录[9]。在国内，廖八根等证明钙调神经磷酸酶参与了耐力运动骨骼肌纤维类型和大小的调控，具有肌肉特异性。但是对于钙调神经磷酸酶下游的一些调节因子以及这些调节因子之间的联系目前还不清楚，待于进一步研究[10]。

2 肌源性调节因子信号调节通路

2.1 肌源性调节因子的结构组成

肌源性调节因子(Myogenic regulatory factors，MRFs)属于碱性螺旋-环-螺旋转录调节因子(basic Helix-Loop-Helix, bHLH)，它可以结合DNA，调节基因的转录，由MyoD、myogenin、myf5、MRF4四个蛋白组成。这四个成员都有同源性的bHLH调节序列，其中碱性区是结合DNA区，HLH是二聚体形成区[11]。MRFs可激活与生肌相关的基因转录，抑制肌细胞增殖，促进分化，在骨骼肌发生早期起到重要的调节作用[12]。同时，MRFs在成肌细胞分化中发挥重要作用，可调控收缩蛋白和调节蛋白同工型在不同时期表达，还可以促使成肌细胞向不同类型的肌纤维分化[13]。

2.2 肌源性调节因子信号调节通路的调节机制

肌源性调节因子对于肌肉表达的调控在于能够激活肌肉特异基因的转录。对于含E盒(E蛋白)的肌肉特异的基因，MRFs成员首先与E12和E47结合形成异二聚体，这个二聚体结合到保守的DNA序列CANNTG(N可以是任意碱基)，也就是E盒上，形成异寡聚物复合体[14]。E盒可以在多数肌肉特异的基因调节区域内找到。成肌细胞分化时会产生MEF-2；而当外源性的MyoD或myogenin表达时，非肌肉细胞也会产生MEF-2[15]，MEF-2会与基因启动子结合来调节基因的表达。

2.3 运动及外界刺激对肌源性调节因子信号调节通路的影响

Walters等利用原位杂交技术检测了6周龄大鼠 MRF4 的转录表达模式，结果显示：MRF4 在不同的纤维类型中存在特异性的表达，尤其在慢肌纤维中高表达[16]。苏艳红等对大鼠进行耐力训练后，观测其肌球蛋白重链及MyoD, myogenin的表达，结果表明:耐力训练没有改变MHCs蛋白表达，耐力训练后MHC-Ⅱx mRNA表达显著减少；耐力训练使MyoD， Myogenin均显著下降。结果说明耐力训练使快型MHC基因表达减少；快型MHC-Ⅱx减少可能与MyoD表达下降有关，MyoD和Myogenin可能参与MHC表达的调节[17]。廖艳萍通过对发育期大鼠进行大强度离心训练，探讨其对发育期大鼠骨骼肌纤维类型及MyoD，myogenin表达的影响，发现大强度离心运动能使发育期大鼠骨骼肌MHC亚型之间发生转化，转化的方向为：MHC-Ⅱb向MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱx、MHC-Ⅱa转化；MHC-Ⅱx向MHC-Ⅱa转化；MHC-Ⅱx，MHC-Ⅱa共同向MHC-Ⅰ转化[18]。这些研究结果都显示，MRFs 家族因子对于成肌分化和肌纤维分型起到重要的调节作用。

3 钙/钙调素依赖性蛋白激酶信号调节通路

3.1 钙/钙调素依赖性蛋白激酶信号调节通路的结构组成

钙/钙调素依赖性蛋白激酶(calcium/calmodulin-dependent protein kinase, CaMK)是真核生物细胞中的胞质溶胶蛋白，由148个氨基酸组成的单条多肽。属于Ca2+/CaM依赖的丝苏氨酸激酶家族, 已发现有四个成员 CaMk Ⅰ～Ⅳ目前研究认为CaMKⅡ和CaMKⅣ可能参与骨骼肌纤维类型的转换。CaMKⅡ的 α、β、γ、δ四种亚型在骨骼肌皆有表达。在细胞内对钙信号的传导有重要的介导作用。

3.2 钙/钙调素依赖性蛋白激酶信号通路的调节机制

激活后的CaMK对细胞产生适应性影响的确切机制还不清楚。Passier等认为当机体持续处于低能量负荷的耐力运动时，骨骼肌细胞内钙离子浓度不断升高，CaMK信号被活化，解除组蛋白去乙酰基转移酶对MEF-2的抑制作用而激活MEF-2，从而诱导慢肌纤维的表达。然而骨骼肌并不表达内源性 CaMKⅣ，因此它可能不参与生理性骨骼肌表型的调控[19]。Kao等的研究发现，在心肌细胞中，CaMKⅣ在256-498氨基酸残基上磷酸化HDACS，并从MEF2结合位点上解离开，暴露出与其它蛋白结合的位点，移位进入了细胞质，这一过程通过一种CRM1机制来实现[20]。

3.3 运动及外界刺激对钙/钙调素依赖性蛋白激酶信号通路的影响

Flück等研究发现，轮跑运动引起大鼠股外侧肌内CaMKII活性升高[21]。Rose等的一项实验通过对正常健康人不同强度自行车运动测试，观察运动时骨骼肌中CaMKII的表达，发现运动时间和强度非常影响CaMKII的活性，在运动1分钟内，CaMKII活性升高迅速，并随运动时间增加持续升高，而运动强度的改变使它的活性升高更快[22]。Smith等发现一次急性大强度游泳运动后，检测到运动后6小时MEF2A显著增加，最终导致运动后24小时GLUT4 mRNA和蛋白水平较对照组显著增加，而在运动后即刻检测到CaMKⅣ和CaMKⅣ活性升高，提示CaMK具有增加MEF-2转录活性效应[23]。

Xiaodong等研究显示，通过趾短屈肌细胞培养试验，在肌肉表型的转变中，CaMKⅣ活性似乎没有发生改变[24]。Akimoto等对小鼠进行4周的自由轮跑试验后，在CaMKⅣ基因切除小鼠骨骼肌中没有检测到CaMKⅣ蛋白活性，因此该作者认为CaMKⅣ不是维持慢肌纤维表型和MHC-Ⅱb向MHC-Ⅱa转换所必需的[25]。

4 细胞分裂素活化蛋白激酶调节通路

4.1 细胞分裂素活化蛋白激酶通路的结构组成

细胞分裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。通常情况下MAPK位于胞浆中，当它受到刺激磷酸化后而被激活，活化的 MAPK入核激活相应靶基因。MAPK家族，在骨骼肌至少有四个家族成员：ERK1/2、JNK、p38MAPK和ERK5，是与细胞生长、分化、肥大、凋亡等相关的信号转导途径中的关键物质[26]。

4.2 细胞分裂素活化蛋白激酶通路的调节机制及运动适应

ERK包括两个高度同源的亚类ERK1和ERK2，ERK1和ERK2分别是44kD和42kD的蛋白质，其同源性约为85%，结合底物的核心区同源性更高[27]。多种胞外刺激可经G蛋白受体、生长因子受体和酪氨酸蛋白激酶受体，经Raf-MEK-ERK级联信号激活ERK，调节转录因子和一些激酶活性，促进细胞增殖、蛋白质合成[28]。研究表明大强度耐力运动和力量练习可激活 ERK1/2、JNK、p38MAPK[29]。

Roth等研究表明，MAPK通路中的 Ras-Raf-MEK1/2-ERK1/2信号通路可以上调慢型纤维 MHC的表达，同时抑制快肌亚型[30]。 Higginson等大鼠骨骼肌实验研究显示，用U0126阻断 ERK1/2 ，骨骼肌细胞MHC-Ⅰ下调，MHC-Ⅱx和MHC-Ⅱb上调。张雪等[31]对大鼠分别进行耐力训练和急性训练发现，耐力训练和急性运动均可激活 ERK1/2信号通路，但两者之间 ERK1/2mRNA表达没有显著性差异，ERK1/2基因表达不受运动强度影响[29]。

但Shi等研究则显示在比目鱼肌中过表达 ERK则上调MHC-Ⅱx和MHC-Ⅱb的表达[32]。以上不同结果可能由于不同骨骼肌中p38MAPK磷酸化状态不同所致。对MAPK所参与调节肌纤维类型转换的信号传导途径不是很明确，且有关运动诱导的MAPK信号通路研究还很少，有待进一步研究。

5 对各信号通路之间可能存在的联系的探讨

通过对以上各分子信号通路的结构组成和调节机制的分析，不难发现：MEF-2在运动骨骼肌纤维类型转换过程中起到了至关重要的作用。运动等外界刺激因素通过调节各信号通路来实现对骨骼肌纤维类型的调控。MEF-2几乎存在于每个信号通路中，并且位于各调节通路的下游位置，它可以激活下游很多重要的结构蛋白。Wu Hai等在带有MEF-2传感器且超表达CaN的杂合子转基因小鼠的骨骼肌中发现，MEF-2活性可以被CaN显著激活[33]。而且MEF-2和CaN信号通路同时激活可以上调如肌红蛋白、肌球蛋白重链和慢型肌钙蛋白等特异基因的表达[34]。根据这些发现可以推测HDAC/MEF-2与CaN信号通路间存在一定的相互作用关系。在MRFs信号调节通路中可看出：MEF-2作为其中的一个中间因子，在调控骨骼肌纤维类型转换的调控中起到了重要作用。同样在CaMK信号调节通路中也是通过激活MEF-2后，从而调节骨骼肌纤维类型的表达。Lin J等利用快慢型肌纤维特异的启动子，在培养的骨骼肌细胞中，发现PGC-1与MEF-2蛋白协同激活慢肌纤维相关基因的转录并能够作为CaN信号通路的靶基因发挥作用[35]。但MEF-2调节其下游结构蛋白的具体机制还不清楚，有待于更深层次的研究。

6 小结

骨骼肌作为人体运动的动力系统，其性能对人体运动能力的重要作用已众所周知。各种外界条件诱导的骨骼肌纤维类型转换研究日趋成熟。但调控骨骼肌纤维表型的各个信号调节通路间的具体联系尚不清楚。MEF-2作为各信号通路调控骨骼肌纤维类型转换的关键因子，在各信号通路中的具体功能与机制，还有待进一步研究。相信随着研究的不断深入，将会为运动诱导的骨骼肌纤维类型转换的研究打开一个新视野。

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