来氟米特对MRL/lpr狼疮鼠疗效及单核细胞趋化蛋白-1的影响*

袁卫东 ，谭 薇 ，夏云飞，曹晓蕾

（1海门市人民医院肾内科，江苏 226100；2南通大学附属医院风湿科；3南通大学医学院）

肾脏是系统性红斑狼疮 (systemic lupus erythematosus，SLE)最常累及的器官之一。研究表明，单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1）作为单核细胞特异的趋化因子在狼疮性肾炎（lupus nephritis，LN）发生发展中起到十分重要的作用。LN肾组织中MCP-1高表达是单核细胞浸润的最主要原因，且两者高度相关[1-2]。SLE患者尿MCP-1水平活动期显著高于非活动期[3]。提示MCP-1/CCL2在LN的发生发展中起到十分重要的作用[4-5]。近年来研究表明来氟米特（leflunomide,LEF）用于治疗LN效果显著，可使LN患者临床症状、体征及免疫学指标明显改善[6-7]，但对其机制研究目前尚不多见。本文观察了LEF对MRL/lpr鼠的作用及其对MCP-1表达的影响，报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组 MRL/lpr狼疮小鼠16只，雌性，7～8 周龄，体重 20±2g，均饲养于南通大学动物实验中心SPF屏障环境。随机分为2组：LEF组（LEF，n=8）、对照组（Con，n=8）。LEF 组于 16 周予以含LEF(35mg/kg·d)的0.5%羧甲基纤维素水灌胃8周,对照组予同体积的0.5%羧甲基纤维素水灌胃8周，于第25周处死所有动物。

1.2 尿蛋白、抗ds-DNA抗体、血清肌酐测定 于10、20、24周时代谢笼留取小鼠24h尿量，考马斯亮蓝法测定尿蛋白含量。25周时测定抗ds-DNA抗体、血清肌酐，按ELISA试剂盒说明书操作。

1.3 肾脏病理检查 将部分肾组织予10%中性甲醛溶液固定、脱水、石蜡包埋、HE染色。观察肾小球数、肾小球硬化数、新月体数、是否存在肾小球血管袢内血栓形成及毛细血管袢坏死等。采用双盲法观察每张切片上100个肾小球中新月体的数量，计算新月体形成率，以评价LN的严重程度[8]。新鲜肾组织OCT包埋后，切片5μm，直接免疫荧光法检测IgG、IgM沉积。

1.4 血液、尿液MCP-1测定 PBS缓冲液洗板2次，在包被有抗MCP-1单克隆抗体的酶联板孔内分别加入标准品或1∶5稀释待检样品，每孔100μL。每孔中加入HRP结合物50μL；室温孵育2 h。洗板3次后每孔加入100μL TMB/底物溶液,避光室温孵育10 min，每孔加入100μL终止液；读取620 nm波长处A值。

1.5 Western Bolt测定肾脏组织MCP-1 新鲜肾组织OCT包埋后，切片5μm，SP法进行MCP-1免疫组化。取小鼠肾脏皮质组织100mg，充分研磨成粉末状，加入蛋白酶抑制剂、蛋白质裂解缓冲液。离心、取上清液提取抗原，并测定蛋白浓度，调整浓度后加样电泳分离蛋白并转移到硝酸纤维素膜上，加脱脂奶粉封闭，再加入抗鼠MCP-1一抗过夜，PBS冲洗15min，置于 1∶5000 二抗，室温反应 1h，PBS 冲洗后暗室显影，待胶片晾干后扫描仪扫描，分析其灰度。

1.6 逆转录多聚酶链反应 （Rt-PCR） 根据Gen-Bank提供的MCP-1、GAPDH基因序列，应用Primer 5.0软件设计引物如下：MCP-1正向引物:5'-AGAAACCAGCCAACTC-3'，反向引物:5'-GCTACAGGCAGCAACT-3'，片断长度 103bp。GAPDH正向引物:5'-ATCGTGGAAGGGCTAATG-3'，反向引物:5'-GGATGATGTTCTGGTGGG-3'，片断长度115 bp。肾脏组织研磨后Trizole法提取mRNA并用紫外分光光度计测定OD260/OD280值，计算RNA含量，使用Rt-PCR Kit进行逆转录反应，合成CDNA。进行PCR反应，总反应体系20μL。内含:10μL 2×QuantiTect SYBR Green I RT-PCR Master Mix;上游引物、下游引物(10μmol/μL)各 1μL,0.2μL Quanti-Tect RTMix；模板 1μL;6.8μL 无 RNase水。反应条件为：50℃ 20min(×1)，95 ℃ 10min(×1)，94 ℃ 15s →49.5℃ 20s→72℃ 30s(×45)。对反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。在凝胶成像系统中拍摄照片并予灰度扫描，将目的基因MCP-1与GAPPH的灰度进行对比，所得的比值为目的基因的相对表达量。

1.7 统计学处理 采用SPSS 13.0统计软件进行统计数据处理，计量资料以表示，多个样本组间差异性比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 LEF对MRL/lpr鼠24h尿蛋白定量、抗ds-DNA抗体滴度及肌酐的影响 对照组MRL/lpr鼠从16周龄开始，尿蛋白逐渐升高。治疗4周后LEF组尿蛋白显著较对照组减少。20周时LEF组尿蛋白水平(1.73±1.32mg)低于对照组(3.9±2.34mg)，两组比较差异有统计学意义 (P＜0.05)；24周时，LEF组尿蛋白水平(1.62±1.25mg)显著低于对照组(5.75±2.33mg)，两组比较差异有统计学意义(P＜0.01)。25周时，LEF组抗 ds-DNA 抗体滴度（39.19±15.77×102 IU/mL）较对照组（69.96±32.77×102 IU/mL）显著降低，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。25周时，血清肌酐浓度LEF组（6.95±3.37μmol/L）与对照组（11.50±2.39μmol/L）相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 LEF对MRL/lpr鼠肾脏病理变化的影响 LEF组光镜下可见：肾小球硬化及间质纤维化程度显著减轻，系膜细胞、系膜基质轻度到中度增生、局灶性硬化、肾间质炎症细胞浸润减轻（图1）。LEF组新月体形成率（0.11±0.05）显著较对照组（0.21±0.07）降低（P＜0.05）。免疫荧光结果显示：IgG、IgM 主要沉积于系膜下、上皮上、内皮下。LEF组IgG及IgM沉积显著较对照组减少（图2）。对照组小鼠肾脏光镜下可见：肾小球硬化，肾小球系膜细胞大量增殖、系膜基质增宽，新月体形成，肾间质内有大量的炎性细胞浸润。

图1 LEF治疗对MRL/lpr鼠的肾脏病理的影响（HE×300）

图2 LEF治疗对 MRL/lpr鼠的肾脏 IgG、IgM沉积的影响（300×）

2.3 LEF对 MRL/lpr鼠血清、尿液MCP-1的影响25周时LEF组血清MCP-1水平较对照组降低 (P＜0.05)。24周时LEF组尿液MCP-1水平与对照组差异有统计学意义(P＜0.05)，见表 1。

表1 LEF对MRL/lpr小鼠血液及尿液MCP-1浓度的影响（，pg/mL）

表1 LEF对MRL/lpr小鼠血液及尿液MCP-1浓度的影响（，pg/mL）

与对照组比较，*P＜0.05

血清MCP-1 尿液MCP-11099.31±391.72 342.70±165.34*对照组 8 1325.45±352.28 487.72±194.57

2.4 LEF对MRL/lpr鼠肾脏MCP-1表达的影响MCP-1主要定位于肾小球系膜区、肾间质炎性细胞浸润处肾小管细胞边缘和肾小管腔内。LEF组MCP-1表达较对照组显著减弱（图3）。

图3 LEF治疗对MRL/lpr鼠肾脏MCP-1表达的影响（SP，1200×）

2.5 LEF对MRL/lpr鼠肾脏MCP-1蛋白表达的影响 LEF组肾脏中MCP-1蛋白表达显著低于对照组，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；LEF组MCP-1相对表达量 0.40±0.02，Con组 MCP-1相对表达量 0.79±0.15，见图 4。

图4 LEF治疗对MRL/lpr鼠肾脏MCP-1蛋白表达的影响

3 讨 论

LEF通过可逆性抑制嘧啶核苷酸从头合成途径的限速酶，从而阻断限速嘧啶核苷酸的从头合成，进而抑制细胞内DNA及RNA的合成，抑制T、B淋巴细胞增生，减少免疫球蛋白产生，LEF还具有抑制蛋白酪氨酸激酶磷酸化的作用[9]。我们研究发现来氟米特干预后可使MRL/lpr小鼠尿蛋白减少，血清肌酐水平降低，肾组织病理改变，提示来氟米特治疗MRL/lpr小鼠LN有效，与Bartlett等[10]报道一致。

合成和分泌MCP-1的细胞有多种，其中单核细胞、巨噬细胞、内皮细胞是分泌MCP-1的主要来源，肾组织内的系膜细胞也可合成和分泌MCP-1[11]。MCP-1是一种低分子量的趋化因子，CCR2是MCP-1的受体，MCP-1与CCR2结合后可通过激活细胞内信号转导通路，从而导致细胞迁移等生物学行为的改变。体外研究发现，MCP-1能诱导单核巨噬细胞的趋化和激活，抗MCP-1抗体能抑制单核巨噬细胞的趋化与激活[12-13]。MCP-1是LN肾脏炎症细胞浸润重要信号[14]，介导炎症细胞在肾炎中迁移、募集及组织的损伤[15]，促进肾间质的损害及肾小球新月体形成[16]。表达MCP-1的MRL/lpr鼠肾小管中聚集有大量巨噬细胞和T细胞，而MCP-1缺陷的MRL/lpr小鼠肾小管中仅有少量T细胞、巨噬细胞,且其肾脏病变程度较轻，尿蛋白减少、生存期显著延长[5]。Zoja等[17]研究发现随着肾炎的进展，MRL/lpr鼠MCP-1mRNA的表达显著增加，与单核细胞的浸润程度呈正相关。Hitoshi等[18]研究发现抗MCP-1抗体能够减轻和延缓MRL/lpr狼疮鼠LN的发生和进展。这些结果均提示MCP-1在MRL/lpr鼠LN的形成中起到十分重要的作用。

本研究发现LEF能显著降低MRL/lpr鼠血清、尿液中MCP-1的表达，减少肾脏组织中的MCP-1的表达和炎性细胞的浸润。提示LEF可通过抑制MCP-1的表达而发挥治疗LN的作用，其机制有待进一步明确。

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