肿瘤转移抑制基因KISS-1和NM23-H1的原核表达与纯化

左芳雷 冯秀娟 陈尚武

肿瘤可以从原发灶处转移至远端器官，这是大部分恶性肿瘤都具有的一大特征，也是导致大多数癌症患者死亡的重要原因。肿瘤转移抑制蛋白能够在肿瘤转移的多个步骤中发挥调控作用，在体内阻止或抑制肿瘤转移过程，是近几年肿瘤领域的研究热点。到目前为止，已经明确具有抑制肿瘤转移功能的基因包括KISS-1基因、KAI1基因、NM23-H1基因等［1，2］。NM23-H1是第一个被发现，也是被研究得最充分的一个肿瘤转移抑制基因。它具有的组氨酸激酶活性，核苷二磷酸激酶活性和3'-5'核酸外切酶活性是其发挥肿瘤转移抑制功能的重要因素［3，4］。KISS-1是新近发现的一个肿瘤转移抑制基因，其编码的Kisspeptin是一类肽类激素，是G蛋白偶联受体GPR45的内源性配体，在抑制肿瘤转移上扮演重要角色［5-7］。以基因表达和直接施用肿瘤转移抑制蛋白来治疗肿瘤是具有广阔发展前景的策略，实际上，国外已经展开了KISS-1 蛋白的临床前检测研究［1］。

本研究对人源KISS-1 和NM23-H1 基因进行了克隆和大肠杆菌表达，并得到了纯化重组蛋白，旨在为将来的临床应用积累坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞组织、质粒和菌株 人乳腺癌细胞、胎盘组织由实验室保藏；pMD19-T simple载体（TaKaRa，大连），大肠杆菌表达载体 pET-30a（+）（Invitrogen，上海）；大肠杆菌E.coli DH5α，BL21（DE3）感受态细胞（全式金，北京）。

1.1.2 工具酶及其他试剂 限制性内切酶，T4 DNA Ligase，Ex Taq DNA聚合酶，DL2000、DL15000 DNA marker等（TaKaRa，大连）；Trizol 试剂（Invitrogen，上海）；M-MLV反转录试剂盒（Promega，北京）；X-Gal、IPTG、抗生素等药品均为进口或国产生物试剂；引物合成及序列测定由博迈德（Biomed，北京）生物技术有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反转录cDNA制备 取人乳腺癌细胞或胎盘组织放入液氮速冻，用研钵研成粉末，加入1mL Trizol振荡混匀，室温放置5min；加入200μL预冷的三氯甲烷，混匀，室温放置5min；4℃12000r/min离心10min；取上清，加入等体积预冷异丙醇，-20℃沉淀1h；4℃ 12000r/min 离心10min，沉淀以70％预冷乙醇洗涤一次；沉淀自然晾干后以20μL DEPC处理水溶解。

参照试剂盒说明书，合成第一链cDNA，步骤为：将 2-5 µL 总 RNA 和 1 µL Oligo（dT）primer 混合，65℃水浴5min；低速离心30s，将液体甩入管底，加入 5 µL 5×buffer和 1 µL反转录酶，混匀；42℃水浴1h；95℃处理5min，冰浴冷却，-20℃保藏备用。1.2.2 KISS-1和NM23-H1的克隆 以胎盘组织cDNA为模板，以引物hKISS-1-F1和hKISS-1-R1扩增KISS1基因，上下游引物分别引入NdeⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点，下游引物5'端弃去终止密码子，使其可以和载体pET-30a（+）C端His-Tag序列相连（表1）；同样，以乳腺癌细胞cDNA为模板，以引物NM23-H1-F1和NM23-H1-R1扩增NM23-H1基因，上下游引物也分别引入NdeⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点，下游引物5'端也弃去终止密码子（表1）。PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 1min，循环 30次；72℃延伸 10min。将PCR 产物连接到克隆载体pMD19-T simple上，转化E.coli DH5α，筛选阳性克隆提取质粒pMD19-KISS-1和pMD19-NM23-H1，并进行测序。测序结果和NCBI上发布的序列进行Blast比对分析。

1.2.3 KISS-1和NM23-H1表达载体的构建和重组菌株构建 以NdeⅠ和XhoⅠ双酶切质粒pMD19-KISS-1，pMD19-NM23-H1和 载 体 pET-30a（+）回收目标片段，以T4 DNA Ligase连接过夜。连接产物转化E.coli DH5α。提取阳性克隆质粒并测序确定目标基因的正确连入，得到表达载体pET30a（+）-KISS-1和 pET30a（+）-NM23-H1。将 pET-30a（+）、pET30a（+）-KISS-1 和 pET30a（+）-NM23-H1分别转化表达宿主E.coli BL21（DE3），得到KISS-1和NM23-H1的大肠杆菌重组菌株。

表1 基因克隆和载体构建所用到的引物

1.2.4 KISS-1的融合表达载体构建重组菌株构建 以pMD19-KISS-1为模板，以引物hKISS-1-F2和hKISS-1-R2扩增KISS-1，上下游引物分别引入NcoⅠ和XhoⅠ限制性酶切位点（表1），PCR产物的TA克隆过程同1.2.2，得到pMD19-KISS-1-fusion。pMD19-KISS-1-fusion以 NcoⅠ和XhoⅠ双酶切连入pET-30a（+）得到融合表达载体 pET30a（+）-KISS-1-fusion，KISS-1N端和载体上的一段已有氨基酸序列相连并含有His-Tag标签。另外，以pMD19-NM23-H1为模板，以引物NM23-H1-F1和NM23-H1-R2扩增NM23-H1，上下游引物分别引入NdeⅠ和KpnⅠ限制性酶切位点（表1），PCR产物的TA克隆过程同1.2.2，得到pMD19-NM23-H1-fusion。将pMD19-NM23-H1-fusion以 NdeⅠ和KpnⅠ双酶切连入到以相同酶切位点酶切的pET30a（+）-KISS-1-fusion中，替换了载体上已有的氨基酸序列和His-Tag标签，将KISS-1融合在NM23-H1C端，得到融合表达载体pET30a（+）-NK-fusion。pET30a（+）-KISS-1-fusion和pET30a（+）-NK-fusion的重组菌株构建方法同

1.2.3。

1.2.5 KISS-1和NM23-H1诱导表达 pET-30a（+）、pET30a（+）-KISS-1和 pET30a（+）-NM23-H1的重组菌株单菌落过夜培养，按0.5％接种于10mL新鲜的LB 培养基中，37℃ 250r/min培养3h 至OD600为0.4-0.6左右，将菌液等分为两份，一份加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，另一份做对照，于28℃ 250r/min诱导表达3h。离心收集菌体，以预冷的PBS缓冲液洗涤两次，溶解于1mL PBS，以320W功率超声波破碎细胞，超声开3s，停5s。采用15％的SDS-PAGE凝胶电泳分析蛋白表达情况。

1.2.6 重组蛋白的纯化 利用pET-30a（+）载体上的His-Tag，采用亲和层析方法纯化KISS-1和NM23-H1重组蛋白。KISS-1和NM23-H1重组菌株过夜培养，按0.5％接种于400mL新鲜的LB 培养基中，37℃ 250r/min培养3h 至OD600为0.4-0.6左右，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，于28℃ 250r/min诱导表达过夜（约8-10h）。4℃ 6000r/min离心收集菌体，以预冷的PBS缓冲液洗涤两次，溶解于10mL PBS，加入1mmol/L的蛋白酶抑制剂PMSF和0.5mg/mL的溶菌酶，冰浴30min。以320 W率超声波破碎细胞，超声开3s，停5s。可溶性蛋白纯化直接将超声波破碎上清液进样到含有Ni-NTA填料的亲和层析柱中，收集以不同浓度咪唑梯度洗脱的蛋白。采用15％的SDS-PAGE凝胶电泳分析回收蛋白。

2 结果

2.1 RNA提取及反转录

采用Trizol抽提人乳腺癌细胞和胎盘组织总RNA，结果（图1）显示，RNA提取效果较好，可以进一步做反转录。以Oligo（dT）primer为引物做反转录，得到cDNA文库，如图2所示，cDNA呈均匀的弥散状态，可以用作PCR克隆的模板。

2.2 KISS1和NM23-H1的克隆

以人乳腺癌细胞和胎盘组织cDNA为模板，设计引物（表1）扩增NM23-H1和KISS-1基因。结果（图3）显示，以乳腺癌细胞cDNA为模板扩增得到了目标大小的NM23-H1基因（467bp），以胎盘组织cDNA为模板扩增得到了目标大小的KISS-1基因（423bp）。

图1 人乳腺癌细胞和胎盘组织总RNA

图2 人乳腺癌细胞和胎盘组织cDNA

图3 NM23-H1（A）和KISS-1（B）的PCR产物电泳

PCR产物经切胶回收，连接T载体pMD19-T simple，阳性克隆进行测序分析。测序结果和NCBI上发布的序列进行Blast比对分析，结果显示与GenBank上公布的KISS-1和NM23-H1基因序列同源性达100％，可以进一步做表达研究。

2.3 表达载体的构建与转化

将KISS-1和NM23-H1分别连接到大肠杆菌表达载体pET-30a（+）上，N端融合His-Tag标签，以便于纯化重组蛋白。在分析了重组KISS-1和NM23-H1的表达情况后，又构建了KISS-1和NM23-H1的融合表达载体，即将KISS-1N端和载体上的已有氨基酸序列相连并含有His-Tag标签，另外将NM23-H1替换载体序列连接在KISS-1N端，这样可以增加KISS-1的表达效率。载体的具体构建结构，见图4。明显的表达条带。

图4 KISS-1和NM23-H1的表达载体构建结构图

图5 KISS-1和NM23-H1表达的SDS-PAGE分析

2.4 重组蛋白诱导表达

pET30a（+）-KISS-1和 pET30a（+）-NM23-H1重组菌株经IPTG诱导，SDS-PAGE电泳（图5）分析显示，NM23-H1得到很好的表达，在20kD处有一条高丰度表达蛋白（箭头所示），表达量占总表达量的50％以上，表观分子量略高于理论值（理论值18.2kD）。而KISS-1没有明显差异蛋白条带。

分析 pET30a（+）-KISS-1-fusion 和 pET30a（+）-NK-fusion重组菌株融合表达KISS-1蛋白情况，结果表明在细胞破碎上清中，KISS-1-fusion有极少量的可溶性表达蛋白，而NK-fusion几乎没有可溶性表达（数据未附）。包涵体SDS-PAGE电泳结果（图6）表明，KISS-1-fusion 即 KISS-1和载体融合的基因得到了大量表达，但是大部分为没有活性的不可溶包涵体蛋白，占总包涵体量的70％以上，其表观分子量为24kD左右，比理论值高5kD（理论值19.6kD）。然而，KISS-1与NM23-H1融合基因没有得到

图6 KISS-1-fusion 和 NK-fusion表达的SDS-PAGE分析

2.5 重组蛋白的纯化

对pET30a（+）-KISS-1-fusion重组菌株表达的KISS-1-fusion包涵体蛋白和pET30a（+）-NM23-H1重组菌株表达的NM23-H1蛋白进行亲和层析纯化，以SDS-PAGE电泳分析纯化效果，结果如图7所示。由图7-A可见，在含有6mol/L脲和300mmol/L咪唑溶液洗脱下，KISS-1-fusion蛋白被洗脱下来，在目标蛋白上方有两条蛋白带，分子量为50kD左右的蛋白带是非特异性蛋白残留，而分子量为35kD大小的蛋白带，推测为KISS-1-fusion发生聚合而得。由图7-B可见，NM23-H1在含300mmol/L咪唑溶液洗脱下得到分离，但是具有两条蛋白带，分子量分别为18kD和15kD左右，推测15kD蛋白带是由18kD蛋白带发生部分降解所致。进一步研究需要通过质谱鉴定来确定纯化后蛋白产生的不同结构。

图7 KISS-1-fusion包涵体重组蛋白（A）和NM23-H1重组蛋白（B）的纯化

3 讨论

研究表明，肿瘤细胞在癌症发展的早期其实就已经开始从原发灶脱离并转移到别处了，肿瘤转移抑制基因编码的蛋白能够在体内阻止或抑制肿瘤转移过程。目前已经发现了20多种肿瘤抑制基因，其中包括能调控肿瘤细胞代谢信号通路的基因以及能够调控肿瘤细胞黏附、迁移、死亡以及血管生成过程的基因［1］。KISS-1是目前研究较多的肿瘤转移抑制基因，其编码蛋白具有抑制肿瘤转移，调节生殖功能以及影响内分泌等作用［7］；NM223-H1是研究较为清晰的肿瘤转移抑制基因，其编码蛋白具有影响信号传导系统的运作，参与微管聚合运动，影响细胞黏合和细胞有丝分裂等［8］。

国内学者早期做过NM223-H1的原核表达［8，9］，得到含有生物活性的KISS-1蛋白，然而，国内研究者还没有关于KISS-1的表达研究。本研究在构建KISS-1重组菌株时发现，没有融合其他序列的KISS-1转化宿主菌后会导致宿主死亡，几乎得不到阳性克隆，转化毒性蛋白表达宿主BL21（DE3）plysS 也得不到阳性克隆，推测KISS-1的本底表达可能对宿主的正常生长和代谢造成影响。将KISS-1与载体序列连接后，KISS-1得到了成功表达，虽然大部分表达产物为包涵体形式。进一步的研究需要鉴定分析纯化蛋白的结构组成，并对其生物学活性进行分析，评价其作为生物药物分子的性能。

另外，利用乳酸菌呈递预防和治疗药物分子实施疾病治疗是近几年研究的热点［10-12］，有些研究已经进入临床试验阶段［13］。本研究所在实验室也对KISS-1进行了以乳酸菌为宿主的分泌型表达，通过NICE系统实现了经过依据乳酸菌密码子偏好性修饰的KISS-1的表达（未发表数据）。这些基础研究为将来重组肿瘤转移抑制基因蛋白和重组菌株投入到临床应用打下坚实基础。

4 结论

本研究从人胎盘组织和乳腺癌细胞中克隆得到肿瘤转移抑制基因KISS-1和NM23-H1，并导入到大肠杆菌BL21（DE3）中表达。研究证明，NM23-H1能够在大肠杆菌中可溶性表达；而KISS-1需要与载体的部分序列融合才能够得到有效表达，且表达产物为不可溶的包涵体蛋白。

［1］Smith SC, Theodorescu D. Learning therapeutic lessons from metastasis suppressor proteins ［J］. Nature Reviews, 2009, 9：253-264.

［2］Yoshida BA,Dubauskas Z,Sokoloff MM, et al. Metastasissuppressor genes：a review and perspective on an emerging field ［J］.Journal of the National Cancer Institute, 2000, 92（21）：1717-1730.

［3］叶苏娟, 朱文.nm23-H1调控肿瘤侵袭转移分子机制研究进展［J］. 生命科学 , 2009, 21（1）：107-111.

［4］Zhang QB, McCorkle JR, Novak M. Metastasis suppressor function of NM23-H1requires its 3'-5' exonuclease activity ［J］. International Journal of Cancer, 2011, 128（1）：40-50.

［5］Kotani M, Detheux M, Vandenbogaerde A. The metastasis suppressor gene KiSS-1encodes kisspeptins, the natural ligands of the orphan G protein-coupled receptor GPR54［J］. The Journal of Biological Chemistry, 2001, 276（37）：34631-34636.

［6］Ohtaki T, Shintani Y, Honda S. Metastasis suppressor gene KiSS-1encodes peptide ligand of a G-protein-coupled receptor ［J］. Nature,2001, 411：613-617.

［7］Popa SM, Clifton DK, Steiner RA. The role of kisspeptins and GPR54in the neuroendocrine regulation of reproduction ［J］. Annual Review of Physiology, 2008, 70：213-238.

［8］侯宇, 赵丽淦, 张美英, 等. Nm23-H1/ NDPK-A 基因在大肠杆菌中的高效表达及产物纯化的研究［J］.中国生物化学与分子生物学, 1998, 14（6）：655-660.

［9］孙艳梅, 赵利淦, 张美英, 等.重组人融合基因Nm23-H1/HbFGF的构建及其在大肠杆菌中表达的研究［J］. 生物工程学报 , 2000, 16（5）：551-556.

［10］Wells JM, Mercenier A. Mucosal delivery of therapeutic and prophylactic molecules using lactic acid bacteria ［J］. Nature Reviews, 2008, 6：349-362.

［11］Steidler L, Hans W, Schotte L, et al. Treatment of murine colitis by Lactococcus lactis secreting interleukin-10［J］. Sciene, 2000, 289（5483）：1352-1355.

［12］Yao J, Wang JY, Lai MG, et al. Treatment of mice with dextran sulfate sodium-induced colitis with human interleukin 10secreted by transformed Bifidobacterium longum ［J］. Molecular Pharmaceutics, 2011, 8（2）：488-497.

［13］Braat H, Rottiers P, Homomes DW, et al. A phase I trial with rransgenic bacteria expressing interleukin-10 in crohns disease ［J］.Clinical Gastroenterology and Hepatology, 2006, 4（6）：754-759.