7个大穗型小麦-黑麦代换系间杂交后代的形态学与SSR分析

姜鹿鸣 田超 李集临 张延明

小麦异代换系是染色体工程常用的基础材料之一，是指通过染色体工程技术把携带外源优良基因的染色体转入小麦遗传背景，替换小麦中的1条、1对或多条染色体所形成的品系或中间种质材料［1，2］。黑麦种质资源中有很多有利于小麦改良的优良基因，如抗白粉病、抗旱、耐贫瘠、抗锈病等基因，对于小麦的产量和品质都有显著提高，目前很多研究已将这些黑麦基因成功的应用于小麦遗传改良上。小麦-黑麦代换系遗传性稳定，育性正常，在生产上可以直接利用［3］。1998年，Robinovich等调查发现，全世界大约有330多个小麦推广品种是小麦－黑麦易位系或代换系［4］，如著名的小黑麦Armadillo是2D/2R 代换系［5］。

简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR）又称微卫星（Microsatellite）DNA，是近年来发展起来的建立在PCR基础上的第二代分子标记，它是由一类短的串联重复序列基序（1-6个核苷酸）组成的简单重复序列［6］。由于SSR具有高水平的多态性、易于检测和共显性等特点，目前广泛应用在小麦研究中。崔会肖等［7］用20对小麦SSR特异引物，对小麦近缘种和小麦—簇毛麦染色体代换系、易位系的基因组DNA进行了鉴定。

为了加强对黑麦的遗传及其应用研究，进一步发掘黑麦优良基因资源，本研究对从小麦-黑麦代换系5R/5A与1R/1D杂交后代中选育的7个大穗型品系进行形态学分析与SSR鉴定，以了解这些品系的遗传基础及更好地利用其对小麦进行遗传改良。

1 材料与方法

1.1 材料

母本为小麦-黑麦代换系5R/5A，表现大穗、多小穗、抗病、有颈毛；父本为小麦-黑麦代换系1R/1D，表现大穗、大粒、小穗排列较密、抗旱，由哈尔滨师范大学遗传实验室培育并鉴定［5］。小麦-黑麦代换系5R/5A与1R/1D（2n=42）杂交后代材料：1-5、1-6、1-7、1-8、1-9、1-10、1-11共 7个品系，由哈尔滨师范大学遗传学实验室创制和提供。中国春（Triticum aestivum cv. Chinese Spring）、黑麦（胜利黑麦）（Secale cereale L.），由哈尔滨师范大学遗传学实验室从黑龙江省农科院引进并保存。

1.2 方法

1.2.1 形态学观察 2012年7-8月于哈尔滨师范大学试验田对7个品系及亲本进行田间统计与观察，随机抽取20株。依据《小麦种质资源描述规范和数据标准》［8］对植株性状进行形态学观察与分析，如株高、穗长、分蘖数、小穗数、百粒重、抗病性、抗旱性、颈毛和紫茎等。

1.2.2 DNA提取 取叶片放入液氮冷冻并研磨成粉末，采用CTAB法［9］提取小麦总DNA，用纯水溶解备用。

1.2.3 SSR 分析 根据任如意等［10］、Robert 等［11］、Saal等［12］方法合成特异性PCR引物，引物的碱基序列、染色体位置、退火温度等信息参见文献［10-12］，合成由大连宝生物公司完成，本试验使用的引物序列，见表1。

反应体系：5μL，1×PCR buffer，1.5mmol Mg-Cl2，200μmol/L dNTP，0.5U Taq 酶，40 ng 引物，40-60 ng 模板DNA。扩增产物经15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染法染色并照相。

PCR程序：95℃ 3min 预变性；95℃变性30s，55℃或57℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次；72℃延伸10min。

表1 PCR特异扩增引物

2 结果

2.1 形态学观察

7个品系的形态学观察结果表明，植株遗传性稳定，具有1R/1D的小穗排列整齐、抗条锈病、叶锈病、杆锈病；5R/5A的长穗、多小穗、有颈毛等形态特点。7个品系均属于大穗型材料，穗长超过14cm，其中1-8品系可达17.0cm，1-11品系穗长达到17.5cm，7个品系的小穗数均超过20个，1-8达到24个，主要性状及穗型，如表2和图1所示。

表2 7个品系及亲本的田间性状

图1 7个品系及其亲本的穗形图

2.2 DNA检测

经电泳和紫外分光光度计检测试验材料DNA，电泳条带都较明显清晰，DNA质量较好。测量OD260/ OD280的比值均接近1.8，提取的DNA能应用SSR-PCR分析（图2）。

图2 DNA琼脂糖凝胶电泳结果

2.3 分子标记分析

用筛选出的引物分析7个品系，结果（图3）表明，有1对引物PSC119.1可以在黑麦和7个品系中扩增出一条长约750bp的特异带，而在中国春中没有结合位点，不能扩增出特征带。说明检测的植株中具有黑麦R染色体组成分。

图3 引物PSC119.1扩增结果

引物 SCM138-5RS，在 1-6、1-7、1-8、1-9、1-10和黑麦中扩增出约188bp黑麦特异片段（图4中箭头所示），该片段在中国春、1-5与1-11中未出现，表明1-6、1-7、1-8、1-9、1-10中导入了黑麦5R染色体短臂遗传物质。引物SCM120-5RL在黑麦中扩增出100-150bp4条清晰条带（图5）。但考虑到marker分布不均等情况，图4中箭头所示位置约为127bp，在此位置7个品系均扩增出特异条带，而中国春未出现条带，从而表明7个品系中导入了黑麦5R染色体长臂遗传物质。引物TSM604-1RS可以在黑麦和7个品系中稳定地扩增出一条长约115bp的特异带（图6），而在中国春中无扩增带纹，表明7个品系中有来自黑麦1R染色体短臂的遗传物质，该引物TSM604-1RS（115bp）可作为识别7个品系的特异标记。

图4 引物SCM138-5RS扩增结果

图5 引物SCM120-5RL扩增结果

图6 引物TSM604-1RS扩增结果

3 讨论

通过代换系间杂交将近缘种属的有益基因导入小麦，是小麦改良的有效途径之一。在供试材料品系小麦-黑麦代换系5R/5A与1R/1D杂交的高代品系中，有的可以直接被观察到兼具双亲性状，例如，1R/1D的小穗排列整齐、抗条锈病、叶锈病、杆锈病；5R/5A的穗长、有茎毛、穗疏等。但是，一些性状是由多个基因共同控制，容易受外界环境的干扰，同时由于基因的表达会有一定差异，所以依靠表型所做的标记只能初步鉴定导入了外源遗传物质。

目前，SSR技术已经成为小麦最为常用和高效的分子标记系统。Iqbal等［13］利用SSR 标记成功鉴定了小麦－单芒山羊草（Aegilops uniarista Vis.）7N染色体异附加系。武军等［14］利用SSR技术对普通小麦与冰草杂交产生的大穗花材料4844的后代株系进行分析，并对大穗多花材料中的冰草P染色体进行了遗传鉴定。Korzun等［15］以34个小麦品种间染色体代换系为材料，利用45个小麦SSR 标记鉴定大部分代换系是正确的。

小麦-黑麦代换系5R/5A与1R/1D杂交，由于5R、5A、1R和1D有部分同源关系，小麦ph基因受R组染色体抑制，有可能产生部分同源联会，从而发生染色体易位；5R/5A与1R/1D杂交，F1会产生4个单价体，单价体容易断裂，断裂重建，也可以产生易位，因此代换系5R/5A与1R/1D间杂交，可以有计划的将1R和5R染色体片段导入普通小麦，创制易位系。

本研究选取黑麦5R、1R染色体的特异SSR引物，结合形态学观察，分析小麦-黑麦代换系5R/5A与1R/1D杂交后代中黑麦的遗传成分，可降低SSR鉴定小麦背景中的外源遗传物质的局限性，今后研究可进一步结合细胞学、GISH等多种方法分析鉴定小麦-黑麦代换系间杂交后代材料，为小麦遗传改良和育种筛选良好的基础材料。

4 结论

本试验利用引物 SCM138-5RS，在 1-6、1-7、1-8、1-9、1-10和黑麦中扩增出约188bp黑麦5RS特异片段；引物SCM120-5RL在7个品系和黑麦中均扩增出127bp的5RL特异片段；引物TSM604-1RS在黑麦和7个品系中稳定地扩增出一条长约115bp的1RS特异带，确定7个品系为黑麦的易位系，7个品系均表现大穗、多小穗、抗病、抗旱等优点，有利用价值，可作为小麦品种改良的基础材料。

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