钙蛋白酶抑制剂MDL28170减轻大鼠缺血再灌注心肌损伤

顾晓明，武 峰，张建英，王跃民，李 娟，张淑苗，杨 敏，周京军，高 峰

钙蛋白酶抑制剂MDL28170减轻大鼠缺血再灌注心肌损伤

顾晓明，武 峰，张建英，王跃民，李 娟，张淑苗，杨 敏，周京军，高 峰

目的我们前期的结果表明，钙蛋白酶抑制剂MDL28170对离体灌注心脏可产生保护作用，本实验评价MDL28170对在体缺血再灌注心肌的保护作用。方法 建立急性缺血40 min、再灌注2 h的大鼠心肌损伤模型；缺血前5 min静脉推注MDL28170（3 mg/kg b.w.），再灌注结束后TTC染色测量心肌梗死面积，原位末端标记法检测细胞凋亡指数，比色法检测血清LDH和组织casapase 3活化的水平。结果 与对照组相比，缺血再灌注心肌出现明显的梗死灶、血清LDH水平升高；MDL28170处理可显著缩小梗死面积，降低LDH水平。细胞凋亡结果显示，缺血再灌注心肌凋亡指数与casapase 3活性显著增加，而MDL28170显著逆转二者的变化。MDL28170对正常心肌未产生明显的坏死或凋亡作用。结论 MDL28170对在体缺血再灌注心肌具有保护作用；抑制钙蛋白酶激活可能是一种行之有效的心肌保护方法。

钙蛋白酶；心肌缺血再灌注；心肌凋亡；心肌保护

随着冠脉溶栓术、经皮冠状动脉腔内成形术、心脏外科体外循环等技术的推广应用，心肌缺血再灌注损伤成为阻碍患者获得最佳疗效的瓶颈问题，因而缺血心肌保护的研究一直是心血管研究领域的重点。N-苄氧羰基-缬氨酸-苯丙氨醛（Benzyloxycarbonyl-Val-Phe-H，MDL28170）是针对钙蛋白酶（calpain）研发的肽类化合物[1]，其膜通透性高，笔者和他人在离体心脏灌流的实验中发现，MDL28170能够抑制钙激

活的中性蛋白水解酶（calcium-activated neutral protease，CANP）活性，进而减少细胞骨架分子胞衬蛋白（α-fodrin）降解、改善钠泵活性，最终改善钙超载、缺血再灌注后心功能、提高心肌存活率[2-4]。本实验旨在观察MDL28170对在体缺血再灌注心肌损伤的影响，以进一步明确其保护效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物与材料 清洁级Sprague-Dawley雄性大鼠，250～300 g，由第四军医大学动物实验中心提供。MDL28170购自Tocris公司，TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡原位检测试剂盒购自Roche公司，氯化三苯基四氮唑（TTC）、伊文思蓝（Evans blue）、4＇，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）购自Sigma公司，caspase 3活性检测试剂盒购自EMD Millipore公司，LDH活性检测试剂盒购自南京建成生物技术公司。

1.2 大鼠在体心脏缺血再灌注模型制备 依据实验室常规操作规范[5]，3％戊巴比妥钠（30 mg/kg，ip）麻醉大鼠，仰卧位固定。肝素化后行颈静脉插管用于给药，针状电极插入左下肢连续监测标准II导联心电图。分离气管并插管后立即正压人工呼吸（呼吸频率50次/分，流量20 ml/kg），从左侧第3、4肋间打开胸腔、暴露心脏，剪破心包膜，在肺动脉圆锥左缘平左心耳根下缘2 mm冠状动脉处进针，用5/0无损伤缝合线穿过心肌层，以备结扎冠状动脉左前降支，引起缺血用。实验中夹闭动脉40 min，引起心肌缺血，解除结扎、再灌注2 h制备缺血再灌注心肌损伤模型。以心电图ST段抬高、T波高耸标志心肌缺血的存在；以抬高的ST段下降，T波逐渐恢复以确定再灌注的成功。

1.3 实验分组 实验随机分为4组，处理如下：①对照组（CON组），进行开胸、冠状动脉左前降支挂线等操作，不阻断冠脉血流；②MDL28170对照组（MDL-C组），在开胸、冠状动脉左前降支挂线等操作后，5 min内完成颈静脉单次推注MDL28170（3.0 mg/kg），不阻断冠脉血流；③缺血再灌注组（IR组），行左冠状动脉前降支夹闭40 min，解除夹闭（再灌注）2 h；④MDL28170处理组（MDL组），缺血前5 min，颈静脉快速推注MDL28170（3.0 mg/kg），之后40 min缺血、2 h再灌注处理。

1.4 心肌梗死面积测量 实验结束后，各组夹闭冠状动脉，从颈动脉注入3％伊文思蓝2 ml；1 min后摘取心脏，去除非心脏组织，左右心耳，4℃生理盐水冲洗心脏，滤纸吸去水分后置于-20℃冻存2 h；之后与心脏纵轴垂直切成1 mm的均匀薄片，浸入1％氯化三苯基四氮唑（TTC）的磷酸盐缓冲液中（pH 7.4），37℃孵育15 min；最后用4％福尔马林固定24 h。根据颜色不同区分各区域，蓝色为非缺血区，红色为缺血区（Area at Risk，AAR）；苍白色为梗死区（Infarct Size，IS）。数码相机采样染色的心脏切片。使用OPTIMAS软件（NIH）测量相关区域面积，用缺血区占左室的面积比值（AAR/LV）反映缺血范围，用梗死区占缺血区的面积比值（IS/AAR）反映心肌死亡程度。

1.5 乳酸脱氢酶（LDH）活性测定 实验结束后获取动物血清。依据LDH催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2，4二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈色的原理，比色法检测LDH活性[6]。简要步骤为：按照南京建成生物技术公司提供的试剂盒要求，在待测样品中加入基质缓冲液与辅酶I，37℃孵育15 min，之后加入2，4二硝基苯肼，酶标仪450 nm处读取吸光值。实验结果以对照组为1，取实验组吸光值与对照组的比值代表各组LDH的相对活性。

1.6 TUNEL染色 常规方法，石蜡包埋组织，制备3 μm切片，依次脱蜡、至水；依据原位末端标记法（TUNEL）原理，按照罗氏公司提供的试剂盒要求进行标本处理[5]。之后，4，6二氨基2苯基吲哚（DAPI）复染细胞核；用配置有FV10-ASW软件的激光共聚焦显微镜（Olympus，FV1000）系统采集图像，每张玻片上随机选择4个区域，正常细胞核为蓝色荧光，凋亡细胞的细胞核呈绿色荧光；计算每100个细胞中的阳性细胞数，用百分比来反映凋亡指数（apoptotic index）。

1.7 天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3（caspase 3）活性测定 再灌注2 h后剪取缺血区心肌组织80 mg，荧光比色法检测caspase 3活性[5]。简要过程为：采用EMD Millipore公司提供的试剂匀浆组织，离心取上清即获得检测样品，37℃下与显色底物Ac-DEVD-pNA孵育2 h，405 nm读取荧光值，以对照组荧光值为1，将处理组荧光值除以对照组，所获比值表示caspase 3的相对活性。实验中同时设立10 μM AC-DEVD-CHO（caspase 3抑制剂）处理的对照组，以确认结果的特异性。

1.8 统计学处理 实验数据用均数±标准误（Mean ±SE）表示，应用Graphpad Prism 4.0统计软件进行分析，多组间差异显著性检验采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两组间比较用Tukey检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MDL28170对缺血再灌注后心肌坏死的影响各组间AAR/LV的比值无明显差异（图1），说明各组的结扎部位相同，具有可比性。与CON组相比，IR组左心室出现明显的梗死灶，MDL28170处理显著缩小梗死面积（图1）。与心肌梗死面积结果相一致，IR组大鼠血清LDH活性显著增加，MDL28170则显著降低酶的活性（图2）。这些结果表明，MDL28170具有减少细胞坏死，提高心肌抗缺血再灌注损伤能力的作用。另外，MDL-C组与CON组的TTC染色和血清LDH水平不存在显著差异，提示MDL28170对正常心肌的存活无明显影响。

图1 心脏组织切片的伊文思蓝与TTC双重染色（上）以及缺血范围（中）和梗死区（下）

图2 MDL28170降低缺血再灌注大鼠血清LDH水平

2.2 MDL28170对缺血再灌注心肌凋亡的影响 与对照组相比，缺血再灌注组心肌组织切片可见大量TUNEL染色阳性细胞，caspase 3的活性显著增加；给予MDL28170显著减少细胞凋亡指数，抑制caspase 3活化（图3、4），表明MDL28170具有抗细胞凋亡作用。此外，凋亡指数和caspase 3的统计结果表明，MDL-C组与CON组间不存在显著差异（图3、4）。

图3 MDL28170减少缺血再灌注心肌凋亡指数

图4 MDL28170减弱缺血再灌注心肌Caspase 3活性

3 讨 论

离体器官研究发现，MDL28170可显著抑制钙蛋白酶活性，改善缺血再灌注后心功能，提高组织存活率。本实验在整体动物观察到，MDL28170可显著缩小缺血再灌注后心肌梗死面积，降低血清LDH水平，减少细胞凋亡指数，减弱caspase 3活化，表明MDL28170是一种有效的心肌保护药物，提示抑制钙蛋白酶活性是防治缺血再灌注损伤的重要途径。

钙蛋白酶是一类钙激活的中性蛋白水解酶。目前发现，这一家族有1～15种亚型[7]，其中CANP4与其它分子结构不同，其作为小亚单位与CANP1和2构成的二聚体即是经典的μ-和m-型。分子结构研究表明，位于催化结构域内的半胱氨酸残基具有亲核性，是酶活性的核心部位。因此，钙蛋白酶又称半胱氨酸蛋白酶。钙蛋白酶在心脏、骨骼肌、肾脏等多种组织表达，心肌主要存在μ-和m-型[8]。由于攻击亲核性基团是MDL28170的作用机制，MDL28170并不能选择性作用于某一种钙蛋白酶，因此，有必要研发不同种类钙蛋白酶的选择性抑制剂，以进一步阐明各自的作用。

再灌注早期是心肌保护性干预的重要时间窗，本实验只评价了缺血前给药的心肌保护作用，因此，有必要观察再灌注早期给予MDL28170的心肌保护效果，以进一步明确其心肌保护作用。

总之，本实验在整体动物水平观察到MDL28170提高缺血再灌注后心肌存活率，同时也提示，抑制钙蛋白酶激活可能是一种行之有效的心肌保护方法。MDL28170对心功能、自由基产生等方面的作用还需进行更多的实验研究。

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The calpains inhibitor MDL28170 protects heart against ischemia/reperfusion injury in rats

Gu Xiao-ming，Wu Feng，Zhang Jian-ying，Wang Yue-min，Li Juan，Zhang Shu-miao，Yang Min，Zhou Jing-jun，Gao Feng
Department of Physiology，Institute of Basic Medicine，Xijing Hospital，The Fourth Military Medical University，Shaanxi Xi＇an 710032，China

Zhou Jing-jun，Email：jjzhou＠fmmu.edu.cn

ObjectiveOur previous studies demonstrated that MDL28170，an inhibitor of calpains，produced protective effects in the isolated heart.This study was to evaluate the effects of MDL28170 on myocardial ischemia/reperfusion injury in vivo.MethodsThe rat hearts were subjected to 40 min ischemia/2 h reperfusion.MDL28170 was given i.v.5 min before ischemia at a dose of 3 mg/kg b.w.bolus.The infarcts were measured by TTC staining，the apoptotic index was evaluated by TUNEL staining，and the level of plasma lactate dehydrogenase（LDH）and myocardial caspase 3 activities were determined by colorimetric assay kit.ResultsCompared with the normal，the hearts in ischemia/reperfusion group exhibited increased infarct size，and enhanced plasma LDH activities.More importantly，MDL28170 significantly attenuated these effects induced by ischemia/reperfusion.In addition，the data of TUNEL staining and caspase 3 activities revealed that there was an increase of cell apoptosis in ischemia/reperfusion group，which was also blocked by MDL28170.The last but not the least，MDL28170 had no effects on myocardial infarcts and apoptosis in the normal.ConclusionThese results provide evidence that MDL28170 protects heart against ischemia/reperfusion injury in vivo.It also suggests that inhibiting activation of calpains is an effective strategy for myocardial protection.

Heart；Ischemia/reperfusion；Myocardial apoptosis；Myocardial protection

R654.1

A

1672-1403（2013）04-0248-04

2013-10-10）

2013-10-23）

国家自然科学基金（81100082，31371181）

710032西安，第四军医大学基础部生理学教研室（顾晓明、张建英、王跃民、李 娟、张淑苗、杨 敏、周京军、高 峰）；710032西安，第四军医大学西京医院心血管内科（武 峰）

周京军，Email：jjzhou＠fmmu.edu.cn