乳酸菌降胆固醇机制的研究进展*

国立东，杨丽杰，霍贵成

1(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室，黑龙江哈尔滨，150030)2(黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨，150040)

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)已成为我国人群的首要死因［1］，也是全球范围内威胁人类健康的主要疾病，其中死亡率最高的是冠心病(coronary heart disease，CHD)［2］，而胆固醇水平升高是导致冠心病的最重要危险因素。血清总胆固醇每降低1%，发生冠心病的危险性可减少2% ～3%［3］。因此，降低血清胆固醇水平已成为预防和治疗冠心病的首要目标。

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)大量栖居于人体肠道内，作为肠道菌群主要的微生物群落，对宿主健康具有一定的促进作用［4］。随着研究的深入，近年来发现人体肠道内的微生物群落与慢性疾病的发生有关［5］，并提出“慢性病的肠源性学说”［6］。因此，作为肠道内有益菌的乳酸菌愈加受到食品及医药工作者的关注。降低血清胆固醇水平作为乳酸菌主要益生功能之一，已得到大量体外和体内(动物和人体)实验证实［7－11］，研究人员基于生长培养基、细胞模型和动物模型已相继提出多种假说论证其降胆固醇的可能机制，但作用机制尚不明晰，尤其是体内降胆固醇机制。文中就半个世纪以来全球学者关于乳酸菌降胆固醇机制提出的各种假说进行总结，并对其存在的问题进行了分析与展望。

1 生长培养基中降胆固醇的机制

乳酸菌降胆固醇机制最早就是基于其生长培养基而提出，主要包括:共沉淀作用、乳酸菌吸收或吸附胆固醇、乳酸菌细胞积累胆酸、抑制胆固醇乳化胶束形成、胆固醇氧化酶和胆固醇还原酶活性等。

1.1 共沉淀作用

共沉淀理论是较早提出的机理假说之一。胆固醇和结合型胆酸共存的培养基中，乳酸菌发酵液pH值维持在6.0时胆固醇稳定存在，pH值低于5.5时体系中胆固醇会沉淀下来［12］，且伴随游离胆酸一起沉淀，即所谓的“共沉淀”现象。游离胆酸的产生是由于乳酸菌具有胆酸盐水解酶(bile salt hydrolase，BSH，EC 3.5.1.24)活性，水解结合型胆酸而生成［7］。此外，若采用水溶性胆固醇，即便pH值低至4.0时也仅有很少胆固醇沉淀下来，因此共沉淀现象的发生与胆固醇以胶束还是非胶束形式添加到体系中有关［13］。胆酸盐有利于维持胆固醇胶束的稳定性，游离胆酸盐的pKa值接近于5.1［14］，酸性条件下会解离并破坏体系中胆固醇胶束稳定性，继而发生共沉淀［12］，因此共沉淀现象的发生不仅依赖于胆固醇胶束的存在也要依赖于环境pH值的高低。然而，人体肠道内pH值在中性范围［15］，虽有研究发现钙离子存在时游离胆酸盐于偏酸性生理条件下也可能发生沉淀［16］，但这种共沉淀效应在人体内到底能发挥多大作用，仍有待于进一步澄清。

1.2 乳酸菌吸收或吸附胆固醇

乳酸菌可以通过细胞壁、细胞膜或细胞质不同程度地吸收或吸附胆固醇。生长在含胆固醇培养基中的乳酸菌，在不控制pH值和控制pH值为6.0两种情况下，从分离的乳酸菌细胞膜中检测到了胆固醇的存在［17］。此外，在1株生长于含胆固醇和结合型胆酸盐培养基中的食淀粉乳杆菌(Lactobacillus amylovorus)细胞内检测到了50%以上的胆固醇，同时胆固醇总量未变，也就是说胆固醇未被乳酸菌降解［18］。近年，研究人员通过扫描电镜直观地观察到了乳酸菌吸附胆固醇到细胞壁上的现象［19］，其中细胞壁肽聚糖的化学与结构特性可以影响胆固醇的吸附特性，确切地说是肽聚糖含有的氨基酸具有结合胆固醇的能力［20］。

乳酸菌细胞壁吸附胆固醇是一种物理现象［20］，而细胞膜吸收的胆固醇在磷脂尾部、上端磷脂以及磷脂双分子层的极性头部区域均有出现，胆固醇在不同区域的富集可能降低乳酸菌细胞膜的通透性与流动性，这也更好地解释了为何生长在含胆固醇培养基中的乳酸菌细胞对超声波或酶裂解作用展现出更强的抵抗力［21］。然而，胆固醇被乳酸菌吸收到细胞内其生物学意义何在至今尚不清楚。

1.3 其他机理

在许多乳杆菌和双歧杆菌属菌株中，均发现乳酸菌细胞内能积累胆酸(cholic acid)，胆酸的积累具有自发性，其驱动力是跨膜质子梯度(ΔpH)，降低胞外pH值可增加积累量，因此可通过肠道微生物产生的短链脂肪酸或乳酸降低肠道pH值，从而可能增强乳杆菌在体内对胆酸的积累［22－23］，为了补偿肝肠循环过程中失去的胆酸量，胆固醇会进一步分解生成新的胆酸，从而达到降低胆固醇的目的。胶束形式存在的胆固醇有利于肠道的吸收［24］，Lye 等［19］通过体外研究发现供试乳杆菌能抑制胆固醇胶束的形成，从而推断其在体内也可能通过这样的方式来降低肠道对胆固醇的吸收。此外，乳杆菌和双歧杆菌等普遍缺乏胆固醇氧化酶活性，然而1株瑞士乳杆菌(L.helveticus)细胞内与细胞外均能分泌胆固醇氧化酶，同时在培养基中也检测到了胆固醇氧化产物1，4-雄烯二酮(ADD)和雄甾-4-烯-3，17-双酮(AD)的存在［25］。胞内胆固醇氧化酶活性的存在，似乎可以解释乳酸菌吸收胆固醇到细胞内的生物学意义，但缺乏直接证据。Lye等［21］研究发现11株乳杆菌属和双歧杆菌属菌株胞内和胞外均可分泌胆固醇还原酶，菌株通过吸收胆固醇到细胞膜上并利用产生的胆固醇还原酶将胆固醇转化为粪甾醇，从而降低培养基中胆固醇含量，这为乳酸菌细胞膜吸收胆固醇的生物学意义提供了一种可能解释。

2 基于细胞模型提出的降胆固醇机制

机体内胆固醇水平高低主要取决于胆固醇的吸收和胆固醇的合成与分解代谢。胆固醇的吸收在肠道内进行，而胆固醇的合成与分解则在肝脏内完成。因此，肠细胞和肝细胞模型成为研究乳酸菌对胆固醇代谢影响的首选靶标。

2.1 影响肠细胞胆固醇吸收相关蛋白的表达

目前，人结肠腺癌细胞系Caco-2细胞模型由于结构和功能类似于分化的小肠上皮细胞，具有微绒毛等结构，并含有与小肠刷状缘上皮相关的酶系，已广泛用作研究肠细胞功能的模型，包括胆固醇吸收。

2.1.1 下调肠细胞NPC1L1的表达

Niemann-Pick C1 Like 1(NPC1L1)作为肠道胆固醇吸收的关键转运蛋白［26］，已成为医药工作者筛选降低胆固醇吸收药物的靶蛋白［27］。

以Caco-2为肠细胞模型，通过体外培养发现嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)ATCC 4356能抑制Caco-2细胞对胆固醇的吸收，而这种作用是通过下调NPC1L1蛋白表达来完成［9］，同时发现该菌株是通过肝脏X受体(LXR)介导的信号转导路径来抑制NPC1L1蛋白表达的，LXR是一种核受体，能调控细胞固醇代谢的许多关键基因［28］。为了进一步明确L.acidophilus ATCC 4356的作用机理，研究人员发现该菌株的热致死细胞并不能抑制NPC1L1表达，由此排除细胞壁组分作用的可能性。通过对菌株培养上清液(CS)、热失活CS、菌株与细胞作用后的条件培养基(CM)及热失活CM不同处理结果的比较分析，发现抑制NPC1L1表达的物质是来自于L.acidophilus ATCC 4356自身产生的可溶性因子，且这种可溶性因子的产生并不依赖于菌株与细胞间的接触，但起作用的可溶性因子具体为何种化合物尚不清楚。随后，这种作用机理在其他种属乳酸菌中也得到了证实［29］，分离于Maasai发酵乳的鼠李糖乳杆菌(L.rhamnosus)BFE5264和源自韩国泡菜的植物乳杆菌(L.plantarum)NR74，两菌种的活细胞均可通过抑制NPC1L1表达来降低肠细胞胆固醇吸收，但不同的是，这2株菌的抑制作用可能与细菌细胞壁组分有关，因为NPC1L1蛋白和mRNA的表达水平并不受2株乳酸菌活细胞代谢物的影响，而热致死细胞和细胞壁提取物均能不同程度地降低NPC1L1的表达。

2.1.2 上调肠细胞ABCG5/ABCG8的表达

腺苷三磷酸结合盒转运蛋白G5和G8(ATP-binding cassette transport G5，ABCG5 和 ATP-binding cassette transport G8，ABCG8)在肠细胞胆固醇流出进入肠腔过程中起重要作用［30］，表达受LXR调控，是其作用的靶基因［31］。

乳酸菌可以通过上调ABCG5/ABCG8的表达来促进肠细胞胆固醇的排出［32］，研究人员发现L.rhamnosus BFE5264和L.plantarum NR74的降胆固醇作用与促胆固醇流出的促进因子ABCG5/8以及脂代谢相关的转录因子LXRα/β有关，并从供试菌株活细胞、热致死细胞、细胞代谢物、细胞壁4个方面分别考察了其对Caco-2细胞ABCG5/8和LXRα/β表达的影响，其中细胞代谢物对4个基因的表达均无影响，而供试菌株活细胞、热致死细胞、细胞壁均能提高ABCG5/8和LXRα/β的表达，不论在mRNA还是蛋白水平均得到了证实，因而推测供试菌株细胞壁在控制ABCG5/8和LXRα/β表达上可能起重要作用。乳杆菌细胞壁是由一个与磷壁酸(壁磷壁酸和脂磷壁酸)、多糖和蛋白质以共价键或非共价键形式结合的厚的肽聚糖层组成［33］，具体是细胞壁中何种组分起作用仍有待于进一步研究证实。

2.2 提高肝细胞胆固醇7α-羟化酶活性

胆固醇7α-羟化酶(CYP7A1)是胆汁酸“经典”合成途径中的限速酶［34］，胆汁酸在肝脏中合成，胆固醇是其合成的前体物质。研究人员以脱脂乳为发酵基料，对19株乳杆菌和20株双歧杆菌发酵脱脂乳后制备的无菌乳清分别处理大鼠原代培养肝细胞，发现大部分乳清能抑制肝细胞胆固醇的合成与吸收并促进胆汁酸的分泌，进一步研究表明干酪乳杆菌(L.casei)SBT2230和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)SBT2912发酵乳清是通过提高胆固醇7α-羟化酶活性来促进胆汁酸分泌的，而这种作用的有效成分可能是源于经乳酸菌修饰的牛乳源化合物或是乳酸菌自身分泌的代谢物［35］。

利用肠道细胞模型研究乳酸菌降胆固醇的机制尚处于起步阶段，基于现有文献，乳酸菌对Caco-2细胞胆固醇吸收的影响机制并不十分明确，尚缺少本质发现，且存在菌株特异性，亟需相关研究报道的支持。此外，影响肠道细胞胆固醇吸收的因素及相关蛋白很多，需全面考虑。相比于肠细胞，肝细胞模型较早地用于乳酸菌对胆固醇代谢的影响，但相关报道尚不多见，且仅停留在现象上，并未得到系统证明。

3 体内降胆固醇机制

以往体内研究关注的重点在于菌株降胆固醇水平的高低，很少探寻其作用机理。随着研究的深入，乳酸菌体内降胆固醇机制也相继被提出，主要体现在3个方面:促进胆固醇分解、抑制胆固醇合成和抑制小肠吸收胆固醇。

3.1 促进胆固醇的分解代谢

胆固醇转变成胆汁酸是机体排出胆固醇的主要途径，胆汁酸作为胆固醇的代谢产物，在人体内主要以牛磺胆酸和甘氨胆酸两种结合态形式存在，并参与肝肠循环［36］。乳酸菌可以促进胆固醇的分解代谢来降低胆固醇，主要通过两种机制实现:一是乳酸菌通过自身产生的BSH介导的抑制胆汁酸重吸收的作用;二是乳酸菌通过提高胆固醇7α-羟化酶活性来加速胆固醇的分解。

乳酸菌产生的BSH可将结合型胆酸水解生成游离胆酸，而游离胆酸相比于结合型胆酸不容易被小肠吸收，大部分不参与肝肠循环而随粪便直接排出体外，由于反馈调节作用导致胆固醇在肝脏内被进一步分解生成新的胆汁酸，从而降低胆固醇［37］。因此，粪便中游离胆酸含量的增加及血清胆固醇水平的降低，将间接指示供试乳酸菌可能是通过其自身产生的BSH来降低胆固醇［8，10］。随着相关研究报道的陆续出现，这似乎已成为乳酸菌降胆固醇的一种公认机制。

此外，粪便胆汁酸分泌量的改变还可能是通过影响胆固醇7α-羟化酶活性来完成。1株L.plantarum KCTC3928活菌株能明显降低C57BL/6小鼠低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)和总甘油三酯(TG)水平，且粪便胆汁酸分泌量明显增加，同时小鼠肝脏中CYP7A1的mRNA和蛋白表达量相比于对照分别上调了80%和60%，因此该菌株的降胆固醇作用是通过提高受试动物肝脏胆固醇7α-羟化酶活性来实现［38］。

3.2 抑制胆固醇的合成

胆固醇主要是在肝脏内从乙酰辅酶A开始经过一系列的生化反应合成，其中3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶是胆固醇合成的限速酶［39］。临床应用的主要降胆固醇药物他汀类化合物就是通过抑制HMG-CoA还原酶活性的机理发挥作用的。乳酸菌同样也能抑制HMG-CoA还原酶活性从而降低胆固醇［40］，但这种抑制作用是何种有效成分通过何种途径来实现的仍不得而知，尚需大量试验证明。

3.3 抑制小肠对胆固醇的吸收

小肠对胆固醇的吸收受许多因素影响，且存在多种参与胆固醇吸收的转运蛋白，包括NPC1L1、AB-CG5、 ABCG8、 ACAT2、 ABCA1、 ABCG1、 ApoE等［26，41－43］。L.acidophilus ATCC4356 以 109CFU/d的剂量灌胃Sprague-Dawley(SD)大鼠后，大鼠血清总胆固醇(TC)、LDL-C和TG浓度明显降低，同时在十二指肠和空肠内NPC1L1的表达也出现了明显降低，这表明该菌株的降胆固醇作用至少部分是通过下调NPC1L1表达介导［44］，这与先前对Caco-2细胞的研究结果相符［9］。此外，乳酸菌能否通过改变小肠其它转运蛋白的表达来降低胆固醇吸收，仍需更多的研究来阐明并证实。

近年来，乳酸菌体内降胆固醇的机制虽有上述一些假说被提出，但仍需大量试验予以支持。同时，体内降胆固醇机制的提出主要基于动物模型试验，尚缺少乳酸菌在人体内降胆固醇的机制假说，这主要是由于人作为实验对象，某些试验材料的获得要受到伦理学的限制。

4 存在问题与展望

虽然国内外研究人员已通过大量试验从生长培养基、肝细胞或肠细胞模型、受试个体几个层面分别提出了乳酸菌降胆固醇的各种机制假说，但其作用方式具有菌株特异性且受多种因素影响，故作用机制复杂，至今尚无定论。

大多数乳酸菌存在的BSH活性，一度成为公认的降胆固醇机制，但BSH活性乳酸菌在体内发挥降胆固醇作用的同时也存在安全隐患，因为BSH作用生成的游离胆酸，如胆酸和鹅脱氧胆酸，容易被其它肠道细菌修饰分别产生脱氧胆酸和石胆酸，而这两种化合物可能与结肠癌的发生有关［45］。因此，BSH活性乳酸菌在应用前必须进行合理的安全性评价。随着近几年研究的深入，胆固醇代谢已成为机制研究的新靶标，试图从胆固醇代谢角度剖析乳酸菌降胆固醇机制，不论在肝细胞或肠细胞模型还是动物模型中均取得了一些进展，但仍需更多的研究来证实，且研究对象尚局限于胆固醇代谢的某几个相关基因，缺乏全面性。目前，乳酸菌对肝脏胆固醇合成与分解代谢相关酶活性的影响，仍停留在现象上，缺乏本质研究。此外，乳酸菌降胆固醇机制的研究多是基于生长培养基、细胞模型或动物模型而提出，均不能反映人体内的真实情况，因此通过人体试验澄清乳酸菌降胆固醇的机制成为当前亟待解决的问题。

近年来，随着越来越多种属乳酸菌全基因组测序陆续完成，转录组学、蛋白质组学和代谢组学等组学技术不断成熟与完善，利用组学技术从整体上挖掘差异菌株及作用受试细胞或个体的基因表达谱、蛋白质表达谱和代谢谱的差异性，通过相关性分析从本质上澄清乳酸菌降胆固醇机制将成为可能，并为研究人体内乳酸菌降胆固醇的机制提供新思路与新方法。同时，组学技术也将成为阐明乳酸菌与宿主交互及其它益生机理的强有力工具。

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