MicroRNA在IgA肾病诊断中的应用

文 璐，文建国，李真珍，刘章锁

(郑州大学第一附属医院肾内科 河南郑州 450052)

MicroRNA(miRNA)是在真核生物中发现的一类具有调控功能的非编码RNA。最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节通路，包括生长发育、细胞增殖和凋亡、信号传导等一系列重要的生命调节过程。已发现miRNA的表达异常可能导致人类多种疾病，如癌症、自身免疫性疾病及肾脏疾病等［1］。IgA肾病是全世界最常见的原发性肾小球疾病，其诊断及疾病的动态监测依赖肾组织活检，探索合适的非侵入性IgA肾病诊断方法一直是肾脏疾病领域中最紧迫的课题之一。miRNA存在于组织、尿液、血液等，目前，国内外尚未有针对组织、尿液及血液中的miRNA与IgA肾病诊断方面作系统阐述的报道，本文就miRNA的生物学特点及其在IgA肾病诊断方面的最新研究进展作一综述。

1 miRNA的发现及生物学特点

1.1 miRNA的发现 1993年，Lee等［2］在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis.elegans)中发现第1个非编码基因 lin－4，它并不编码蛋白质。2000 年，Reinhart等［3］又在线虫中发现第2个非编码基因let-7。随后更多的非编码基因被发现，其长度大约在20～25个核苷酸，这些成员被命名为微小RNA(miRNA)。

1.2 miRNA的生物学特点 miRNA是新近证明的一类高度保守的、内源性非编码的小分子RNA，在转录后水平调节基因的表达［4］。miRNA基因首先在细胞核内由RNA聚合酶Ⅱ转录，最初产物为大的具有帽子结构和多聚腺苷酸尾巴的pri-miRNA。pri-miRNA在核酸酶Drosha和其辅助因子Pasha的作用下产生含有70个核苷酸组成的pre-miRNA。随后RNA-GTP依赖的核质/细胞质转运蛋白Exportin5将pre-miRNA输送到细胞质中。在另一个核酸酶Dicer的作用下，premiRNA被剪切产生约为22个核苷酸长度的双链miRNA，接着双链miRNA分子被解链，最终形成成熟的单链miRNA，成熟的单链miRNA很快结合到RNA诱导的沉默复合体miRNP(RISC)中，并可通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA。通过与靶基因的3’UTR区互补配对，指导miRNP复合体对靶基因mRNA进行切割或者翻译抑制［5］。

2 IgA肾病及其诊断中的新问题

2.1 流行病学及临床特点 IgA肾病是1968年由法国学者J.Berger和N.Hinglais首先描述和命名的，其病理特点是在肾小球系膜区和(或)肾小球毛细血管襻出现IgA或以IgA为主的多种免疫球蛋白及补体成分的沉积，同时伴有不同程度的肾小球系膜细胞增生和细胞外基质的堆积［6］。IgA肾病是成人和儿童慢性肾损伤最常见的原因，在确诊后10～25 a内有30% ～40%的患者发展为终末期肾脏疾病(ESRD)［7］。以青壮年男性高发［8］，起病前多有上呼吸道感染等诱因，临床表现以发作性肉眼血尿和(或)持续性镜下血尿最为常见，可伴蛋白尿。IgA肾病的发病机制目前尚不完全清楚。近年来，不少研究发现IgA1异常糖基化可能在这一过程中发挥重要作用，由于IgA1糖基化异常，更有利于IgA在系膜区沉积［9］。此外，免疫调节异常、基因多态性、遗传因素等其他因素在IgA肾病的发生及进展过程中也扮演了重要的角色。

2.2 IgA肾病诊断 IgA肾病的诊断依赖肾组织活检，目前尚无其他诊断手段取代肾组织活检这一标准方法。虽然大量研究显示了多种炎症因子、细胞因子及免疫活性物质在尿液或血液中的表达及变化可能在IgA肾病的诊断方面有重要意义［10］，但其无特异性，也不能确诊该疾病。最近，不少研究发现miRNA作为基因水平的调节物质，其表达异常可以导致IgA肾病患者肾组织细胞结构改变及类型的转化、细胞信号传导异常、炎症因子释放、免疫分子结构改变等［11-13］，从而引起肾组织损伤，乃至肾小球硬化、肾小管萎缩和肾间质纤维化，可以推断miRNA表达水平与IgA肾病的病情程度有相关性。然而，miRNA在IgA肾病的研究尚处于起步阶段，其在尿液或血液中的表达与IgA肾病病理形态学改变是否具有特异的相关性仍需进一步研究。探索miRNA导致IgA肾病并使其进展的发生机制有助于IgA肾病的早期诊断，为寻找IgA肾病新的诊断标志物指明了方向。

3 miRNA与IgA肾病

3.1 组织中 miRNA 与 IgA 肾病 Dai等［14］应用芯片技术通过对11例肾活检证实为IgA肾病患者的肾组织进行miRNAs筛选，共鉴别出132种miRNAs，与正常对照相比有66种miRNAs表达呈显著性差异，其中31种miRNAs表达下调，35种miRNAs上调，提示miRNAs可能参与IgA肾病的病理发生过程。肾小管萎缩和肾间质纤维化预示IgA肾病预后不良，肾小管上皮细胞、足细胞可能通过上皮－间充质细胞转化(EMT)发生纤维细胞表型转化促使IgA肾病患者肾脏纤维化［15］。曾有研究显示miR-200家族、miR-205调控E-box抑制因子1(ZEB1)和Smad干扰蛋白1(SIP1)mRNA的表达，进而上调 E-钙粘素(E-cadherin)水平，防止EMT，减缓肾脏纤维化进程［12］;miR-192通过作用于SIP1和ZEB1 mRNA的表达调控胶原的产生，介导转化生长因子(TGF-β)诱导的细胞外基质 (ECM)积聚［13］。Wang 等［15］通过对 43 例 IgA 肾病患者、15例非炎症性肾小球硬化症患者和20例肾癌切除术后患者的正常肾组织的研究发现:与正常对照组相比，IgA肾病组患者肾组织切片中 miR-141、miR-205、miR-192呈高表达，而 miR-200c呈低表达;与非炎症性肾小球硬化症组相比，miR-192、miR-141、miR-205、miR-200a、miR-200b、miR-429 表达水平明显上调;miR-192表达水平与肾小球硬化程度密切相关;miR-205表达水平与肾小管间质纤维化程度相关;miR-141、miR-200c表达水平与EMT密切相关。该研究表明肾组织中miR-141、miR-192、miR-200c和miR-205与IgA肾病的严重程度及病情的进展呈显著相关性。有研究表明miR-146a和miR-155对淋巴细胞和髓系细胞的分化、成熟和功能具有显著的多阶段调控作用［16，17］，不少文献报道它们参与先天性和获得性免疫应答，而在IgA肾病的病理生理过程中，免疫反应占重要地位［11］。2011年，Wang等［11］在 IgA 肾病组与正常对照组肾组织中对这两种miRNAs表达水平进行了分析。该研究表明，IgA肾病组miR-146a和miR-155表达水平均高于正常对照组，推断这两种miRNAs与IgA肾病免疫应答所致的炎症因子的释放有相关性，而炎症因子可导致肾组织损伤。

3.2 尿液中miRNA与IgA肾病 尿液中的miRNA来自尿液胞外体，尿液胞外体是释放到细胞外环境小的结合到膜的囊泡，起源于每个肾节段，其内富含的miRNA可以作为肾功能不全和肾脏结构受损的生物标志物［18］。近年来，许多研究人员开始注意到尿液中的miRNA具有稳定性高、不易被降解，重复性及特异性高的特点，并进行一系列研究，其中香港大学Wang等对尿液中miRNA与IgA肾病的关系研究甚多。2010年，Wang等［19］在IgA肾病患者与健康人群的尿沉渣检测中发现miR-200a、miR-200b、miR-429表达下调，且其降低程度与疾病的严重程度相关。这是首次通过对尿液中miRNA的检测进行疾病诊断，提示尿液中miRNA表达水平的改变可作为IgA肾病病情程度的判断标志。2011年，他们又选取了与免疫相关的两种miRNA:miR-146a和miR-155，发现与健康人群相比，IgA肾病组尿液中miR-146a和miR-155表达均上调，与之前在肾组织中的结果相同，且随着尿液中这两种miRNAs表达水平的升高，尿液中某些促炎性细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α 等)的表达水平降低，由此推断miR-146a和miR-155表达上调抑制某些促炎性细胞因子的产生［11］。有文献显示，转化生长因子-β1(TGF-β1)是IgA肾病肾脏进行性纤维化的主要介质，Smad是TGF-β1下游信号转导通路的重要组成部分，然而TGF-β1/Smad与IgA肾病进展之间的分子机制仍然不十分清楚［20］。之前有研究表明肾实质细胞中的一些 miRNA包括 miR-21、miR-29家族、miR-93、miR-377、miR-216a 经 TGF-β1 刺激得到调控［21］，提示这些miRNA可能是TGF-β1/Smad信号通路的转录靶点。2012年，Wang等［20］通过在IgA肾病患者与健康人群比较中发现，IgA肾病患者尿液中miR-29b、miR-29c表达下调，而miR-93表达上调。此外，IgA肾病患者尿液中 miR-21、miR-29b、miR-29c、miR-93 表达水平与尿液中Smad3 mRNA表达水平显著相关。该研究表明 miR-21、miR-29b、miR-29c、miR-93 可能是 TGF-β1/Smad3信号通路的转录靶点，且在IgA肾病进展过程中担任重要角色。

然而，到目前为止，尚无技术手段能够检测尿液中这些特异性的miRNA所来自的特定细胞，这些miRNA有可能来自脱落的肾小管上皮细胞和足细胞，但不能直接证明［19］，也有可能来自上尿路或下尿路的细胞，而非肾脏［20］。尽管如此，由于尿液收集无创性、获取方便，若能以尿液中的miRNA作为IgA肾病诊断标志物，临床对于IgA肾病的诊断将更为便捷，患者更容易接受。因而，围绕尿液中miRNA进行研究，对发现IgA肾病新的诊断标志物有重要意义。

3.3 血液中miRNA与IgA肾病 血液中的miRNA存在于血细胞或血液胞外体中，血液胞外体与尿液胞外体类似，能够反复冻融而不被降解，亦能够保护其不被RNA水解酶(RNAses)降解［22］。可能由于循环血中所含的miRNA特异性较低，故国内外有关循环血中miRNA与IgA肾病的研究较少。近年来研究发现，IgA肾病的患者血清及肾脏中沉积的IgA1均出现糖基化缺陷，即分子铰链区O-糖连接的唾液酸和或半乳糖减少，造成半乳糖或N－乙酰氨基半乳糖暴露增多，该发现已经得到广泛认同并被认为是IgA肾病发病的关键因素，但具体发病机制尚不十分清楚［23］。Grazia等［24］发现核心酶 β1，3 半乳糖基转移酶(C1GalT1)的低表达可能导致IgA1糖基化缺陷，通过对IgA肾病患者的外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)与健康对照组作比较，发现在IgA肾病患者的PBMCs中37种miRNAs存在差异性表达，其中miR-148b表达上调，引起 C1GalT1低表达使IgA1分子出现糖基化缺陷，沉积于肾小球系膜区，可触发系膜细胞向炎症细胞和纤维细胞表型转化［25］，亦可触发炎症性瀑布样反应、上调TGF-β等，导致肾组织损伤。血液易于采集，来源于其中的miRNA稳定性强、不易被降解，将血液中的miRNA作为IgA肾病诊断的标志物亦是一个值得探讨的方向。

4 展望

miRNA在肾脏疾病领域的研究方兴未艾。miRNA的发现丰富了IgA肾病发生的分子机制，促使我们对IgA肾病的致病机理和调控通路进行重新审视和理解。上述研究表明miRNA有可能成为IgA肾病新的诊断标志物，尤其尿液及血液中的miRNA，收集无创、不易被降解。虽然，已有大量研究表明miRNA的表达水平与IgA肾病具有相关性，但其仅限于理论研究，未在临床进行大样本的验证，其作为诊断指标的特异性及灵敏度需要更深入的临床研究，才可在临床进行推广应用。

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