VEGF-C及其受体VEGFR-2/3与肺癌关系的研究进展

沈飞琼 综述 魏素菊 审校

恶性肿瘤持续性生长、转移均需要新生血管的支持。VEGF-C是血管内皮生长因子家族的新成员，是由Joukov等 从人前列腺癌细胞系中分离纯化得到的，是1种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂原，可调节肿瘤血管新生以及淋巴血管生成，促进肿瘤细胞生长转移。近几年研究显示，VEGF-C诱导的淋巴血管生成与肺癌生长、转移及预后有着密切的关系［1］。

1 VEGF-C-VEGFR-2/3轴

1.1 VEGF家族、VEGFR 成员

VEGF(vascular endothelial growth factor)家族的不同组成成员作为内皮细胞重要的调节因子，控制着血管生成(angiogenesis)、淋巴管生成(lymphangiogenesis)、血管发生(vasculogenesis)、血管通透性(vascular permeability)以及内皮细胞存活(endothelial cell survival)等。

哺乳动物的 VEGF家族包括 VEGF-A，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，PIGF(胎盘生长因子placenta growth factor)以及新近发现的病毒VEGF-E(orf virus VEGFs)。其中，VEGF-C、VEGFD关系最为紧密，两者由于相似的结构和功能，构成了VEGF家族的一个亚族。

人VEGF-C是最早被发现的促淋巴管生成因子，其基因位于染色体4q34，编码蛋白含有419个氨基酸残基。其合成的前体蛋白通过蛋白裂解可形成成熟，后者与VEGFR-3(Flt-4)的亲和力提高了400倍，同时还可以与VEGFR-2(Flk-1)结合，两者在促进肿瘤淋巴血管生成以及促进肿瘤细胞生长转移中起着至关重要的作用。VEGF-D亦通过与VEGFR-3相结合使受体发生自身磷酸化，通过胞质内信号转导，使DNA有丝分裂增强，导致细胞增殖［2］。此外，VEGF-D表达的肿瘤不仅微血管密度增加，还增加了丰富的周边和瘤内淋巴管［3］。而 Harris等［4］通过比较小鼠肿瘤异种移植模型，更进一步指出VEGF-D与VEGF-C相似，蛋白裂解后与受体的亲和力提高，在肿瘤血管生成及转移中发挥生物学作用。

VEGF家族受体(VEGFR)包括3种蛋白酪氨酸激酶:VEGFR-1(fms-like tyrosine kinase-1，Flt-1)、VEGFR-2(kinase insert-domaincontainin receptor，KDR/fetal liver kinase，Flk-1)、VEGFR-3(Flt-4)以及2种非蛋白激酶协同受体，即神经纤毛蛋白NRP-1和NRP-2［5］。VEGFR-1和VEGFR-2主要在血管表达，与血管生成有密切关系;VEGFR-3由FLT4基因编码，在妊娠中期以后其表达仅局限于发育中的淋巴血管内皮细胞，与淋巴管生成有关;但VEGFR-3的表达也被发现于肿瘤新生血管内。更有研究表明，VEGFR-3的突变失活可诱发淋巴水肿，也间接地给VEGFR-3在淋巴管的发育及功能上所起的重要作用提供了支持。NRP-1和NRP-2在氨基酸序列上约有47%的同源，有着相似的结构;且在某些肿瘤细胞及心、肺、肝等组织中有着重叠表达［6］。NRP-1主要在轴突导向、神经纤维成束、细胞迁移以及成人神经细胞的损伤修复等过程中发挥重要作用［7］。然而，NRP-1在多数肿瘤细胞中也有表达。NRP-2最初也是在神经系统中发挥重要作用，最近发现其在肿瘤血管淋巴管形成、发育及肿瘤的生长转移等方面同样起着重要作用［8］。VEGF-C和VEGF-D均可以与NRP-2结合，并且NRP-2参与了VEGFR 3的信号转导。

1.2 VEGF-C-VEGFR-2/3轴的信号转导通路

VEGF-C与VEGFR-2结合，可促进血管内皮细胞分化增殖，血管生成;促进内皮细胞迁移，形成新生血管;促进内皮细胞存活;增强毛细血管的通透性;且维持血管的正常功能。VEGF-C与VEGFR-2结合，可通过PLCy-磷脂酰肌醇途径和Ras-MAPK途径激活MAPK，从而促进血管内皮分裂、增殖;可促使Src激酶、局部黏着斑激酶(FAK)激活，同时，PI3K-AKT/PKB途径亦参与血管内皮细胞的迁移，形成新生血管，后者还促进内皮细胞存活，并抑制其凋亡，且可刺激内皮细胞产生NO，NO能促使血管平滑肌松弛，从而使血管维持其基础舒缩的功能。另外，VEGF-C刺激VEGFR-2，介导肿瘤血管内皮细胞DNA合成和增殖，诱导内皮细胞的增殖、迁移，降低内皮细胞间的黏附，易于肿瘤细胞生长转移。

VEGF-C与VEGFR-3结合，一方面，引起VEGFR-3胞内区酪氨酸Y1230/Y1231发生自磷酸化，活化细胞骨架蛋白Paxiilin、信号衔接蛋白Src或Shc、生长因子结合蛋白Grb2，暴露激酶区PYXNY短肽序列，并被VEGF-C的SHC(VEGF同源区)的PTB识别、结合，诱导活化CRB2/ERX1/2和PI3K/AKT信号通道，从而触发MAKP级联反应，启动DNA复制，诱导淋巴管内皮细胞机动蛋白重组，刺激内皮细胞增生;而VEGFR-3酪氨酸残基Y1063发生自鳞酸化后，诱导活化CRKⅠ/Ⅱ和c-Jun氨基末端激酶gNK1/2，引起细胞内信号级联反应，促使淋巴内皮细胞有丝分裂、增殖;从而使新生淋巴窦生成及肿瘤转移。

另一方面，通过蛋白激酶C(PKC)依赖的p42/p44 MAPK活化途径和PI3K/AKT磷酸化产生的信号诱导淋巴管内皮增生，降低淋巴管内皮细胞间的黏附，提高淋巴管通透性，使产生VEGF-C的肿瘤细胞可能更易浸润至淋巴管内，导致肿瘤细胞经淋巴道转移，即在肿瘤细胞和淋巴管内皮之间VEGF-C-VEGFR-3形成一旁分泌通路，参与调节淋巴管的增生及其通透性，从而影响肿瘤淋巴管生成和区域淋巴结转移。

2 VEGF-C、VEGFR-2/3与肺癌的关系

2.1 VEGF-C、VEGFR-2/3在肺癌组织中的表达及其预后价值

研究表明，在NSCLC组织中VEGF-C基因水平上调，是由肺癌细胞分泌，并通过自分泌的方式作用于细胞膜上的VEGFR-3(Flt-4)，与非小细胞肺癌的发生有一定关系。实验和临床研究发现VEGF-C尚还与肿瘤恶性进展有关，在体外实验中，下调VEGF-C蛋白的表达可抑制肺癌细胞的增殖和侵袭作用［9］。VEGF-C与NSCLC中淋巴管的生成及淋巴结转移密切相关，Liu等［10］亦报道了，通过降低NSCLC患者VEGF-C表达，可减少淋巴结转移;VEGF-C表达可作为肺癌患者判断淋巴转移的估计指标之一。VEGF-C表达越多，治疗效果越差［11］。且VEGF-C 过表达与 NSCLC 预后差有关［12，13］。Chen 等［14］指出，VEGF-C免疫组化强阳性有可能是可切除的I期NSCLC早起复发及预后差的一项生物学指标。

VEGF-C表达与NSCLC临床分期和淋巴结转移有关，与患者年龄、性别、病理类型、肿瘤大小、分化程度、吸烟情况等无关，Zeng更进一步指出VEGF-C在NSCLC患者外周血、淋巴结及肺癌组织中的表达互呈正相关。且外周血中VEGF-C与淋巴结及肺癌组织中的VEGF-C生物学意义相似，该论断为应用外周血替代淋巴结或肺癌组织检测VEGF-C以诊断NSCLC和预测淋巴结转移和分子分期提供了理论依据。血清VEGF-C也是一个术前诊断淋巴结转移的生物学标记，结合螺旋CT，该诊断更明确［15］。血清VEGF-C含量越高、螺旋CT呈阳性，预后更差。

VEGF-C能促进淋巴结转移，这一过程受VEGF-C自分泌环强度的影响，VEGF-C/VEGFR-3的比率可能在NSCLC的淋巴结转移中是一个强有用的预后因素。VEGF-C、VEGFR-3在癌细胞浸润与淋巴结转移之间存在着密切的关系，即在癌细胞和淋巴管内皮间VEGF-C与VEGFR-3可能形成一条旁分泌通路，参与调节淋巴管的增生及其通透性并影响癌细胞的转移方式［16］。

VEGF-C、VEGF-D之间存在协同作用，它们在NSCLC组织表达的相关性提示其表达可能受同一基因调控。两者共同促进淋巴结转移，使肿瘤细胞更容易进入淋巴管，刺激肿瘤生长，并有望作为检测NSCLC淋巴结转移及判断预后的指标之一。T.Niki等研究发现，在发生转移的肿瘤细胞中，VEGF D∶VEGF C的比值相对于没有发生转移的个体是下降了，并且认为这个比值比单一评价VEGF-C在肿瘤转移中的作用更加有意义。

2.2 VEGF-C通过介导淋巴血管形成促进肺癌转移

淋巴血管形成过程是肺癌经血管及淋巴管途径生长转移的必要过程。VEGF-C与其受体在内皮细胞结合，触发信号传导，以此来调节淋巴血管的形成过程，从而促进肿瘤生长和转移。

近年研究发现［17～19］，VEGF-C是相对特异的淋巴管生长因子，与淋巴管上皮有很高的化学亲和性，可以诱导淋巴上皮增殖和淋巴窦新生，促进肿瘤细胞的淋巴结转移，在淋巴管生成机制中起着重要作用。其作用机制可能为VEGF-C与VEGFR 3结合后使得后者发生磷酸化，继而激活细胞内多条信号传导通路，使得配体与受体结合信号与淋巴管内皮细胞增殖、分化、迁移、抗凋亡等重要生物学行为偶联，最终在细胞外基质及淋巴管内皮细胞的周围细胞环境下形成新生淋巴管。

应用淋巴特异性标记物LYVE-1进行免疫染色，发现VEGF-C可调节肿瘤外周淋巴血管生成，它不仅在肿瘤外周诱导形成新的淋巴血管，还可以使已存的淋巴血管进行增生。肿瘤细胞VEGF-C过表达亦可引起外周淋巴血管直径和数量的增加。VEGF-C还可促进新生淋巴管与已存淋巴管愈合，使肿瘤细胞从新生淋巴管进入淋巴结，发生淋巴结转移，进而通过淋巴系统向全身其他器官扩散。VEGF-C尚还可以促进血管与淋巴管愈合，增加肿瘤与血管的接触面积，以便更好的提供氧气以及营养物质;此外，还可以增强血管通透性，有利于肿瘤细胞从血管中穿出到达转移部位。

最近，Hirakawa等［20］提出新的观点，认为VEGF-C是在肿瘤发生淋巴转移之前，先在前哨淋巴结通过与其受体形成网络调控体系，为肿瘤转移提供微环境，进而促进肿瘤转移的。

2.3 VEGF-C与VEGFR-2或VEGFR-3结合抑制凋亡、促进转移

VEGF-C与受体VEGFR-2结合，通过PI3K依赖的途径激活抗凋亡蛋白Akt/PKB。PI3K是由接头亚基p85和催化亚基p110组成的异源二聚体，p85亚基有2个SH2区，当受到VEGFC刺激时可与磷酸化酪氨酸受体结合，从而招募p110到细胞膜，催化底物磷酸化，从而激活PKB;同时VEGF-C还可以上调抗凋亡蛋白Bcl-2以及AKT。H.Miyake等认为，Bcl-2过表达可以增强肿瘤细胞的转移能力，还可以促进凋亡抑制蛋白家族中成员XIAP、Survivin等表达。VEGF-C与VEGFR-2结合除了通过PI3K-PKB途径外，还可以经C-Src激活PLC-r，通过IP3/DAG双信使途径升高［Ca2+］，产生 PKC。PKC通过 Raf-1-MEKERK1/2途径，而不是经典的Ras-Raf-MEK-MAPK途径，以此增强细胞增殖繁衍的能力，提高肿瘤细胞在转移部位的存活率。

在同一组织中VEGF-C结合VEGFR-3的亲和力比结合VEGFR 2的亲和力高3倍多。因此，VEGF-C和VEGFR-3成为淋巴管生成的重要信号转导通路。

VEGF-C与VEGFR-3结合后也通过类似于VEGFR-2通路的方式抑制肿瘤细胞凋亡，不同的是还可以促进淋巴细胞存活。Liu等［21］检测VEGF-C及其受体VEGFR-3在肿瘤细胞中mRNA和蛋白表达，证实了VEGF-C表达与VEGFR-3表达密切相关，且与外周新生淋巴管的生成密度高度相关。

VEGF-C与VEGFR-3结合，引起VEGFR-3自身磷酸化，通过PI3K引起Akt的Ser 473、Thr 308磷酸化，激活Akt。反之应用PI3K抑制剂渥曼青霉素(wortmamin)时，VEGF-C的刺激将不再激活Akt。其不同于VEGFR-2途径的是，VEGFR 3途径激活Akt与PI3K的p85调节亚基无关。

Zhu等［22］认为IGF-1(胰岛素样生长因子-1)能增强VEGF-C表达水平，且呈剂量依赖关系;另外，IGF-1能加强AKT和ERK1或ERK2的磷酸化作用，应用LY294002抑制AKT磷酸化能完全阻断IGF-1诱导的VEGF-C上调，应用PD98059抑制ERK1或ERK2磷酸化能减少IGF-1诱导的VEGF-C表达。该研究确定了PI3K-AKT和MAPK-ERK1/2的信号途径参与了IGF-1诱导的VEGF-C上调，且在淋巴结转移中起着重要作用。

2.4 以VEGF、VEGFR为靶点的肺癌治疗药物

以肿瘤血管为靶点的抗肿瘤治疗最初是由Folkman提出的，后被深入研究并且用于抗肿瘤传统治疗的辅助手段。这种疗法可直接杀伤肿瘤内部血管，从而达到阻断肿瘤血液供应得目的。

2.4.1 VEGF靶向药物 贝伐单抗(Bevacizumab，Avastin)是1种针对VEGF-A的人源化IgG1单克隆抗体，可阻断VEGF的生物功能，使得VEGF不能与受体结合。单用贝伐单抗对肺癌的控制率约为52%。对于贝伐单抗联合化疗的肺癌一线应用，ECOG4599(贝伐单抗联合卡铂/紫杉醇)结果显示可以提升进展性NSCLC患者的生存时间，基于该结果美国FDA已经将贝伐单抗联合卡铂/紫杉醇推荐为进展性非鳞状细胞NSCLC的一线治疗;而将贝伐单抗作为一线药物的另一项大型Ⅲ期临床试验Avail［23］(贝伐单抗联合吉西他滨/顺铂)在总生存时间上并未得出阳性结果，故很多国家未批准该药的一线应用。而贝伐单抗联合化疗治疗晚期肺癌疗效可显著提高，因为肿瘤血管正常化降低了肿瘤细胞间质的压力，改善了具有细胞毒性的抗癌药物进入肿瘤组织的传递方式，发挥了协同效果［24］。贝伐单抗联合表皮生长因子抑制剂(厄洛替尼)治疗晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者的Ⅱ期临床试验结果证明，厄洛替尼与贝伐单抗联合治疗比单用厄洛替尼的患者提高了1年生存率，不良反应较少，可能成为肺癌二线治疗的最佳方案。

VEGF-Trap是由人VEGFR-1和VEGFR-2片段与人IgG的恒定区融合而成，与VEGF结合后阻断信号传导，从而起到抑制血管生成的作用。它与VEGF的亲和力大概为VEGF单克隆抗体的100倍，但具有相似的药物代谢动力学。VEGF-Trap对非小细胞肺癌的生长抑制率约为40% ～50%，并且降低了肿瘤中微血管密度［25］。VEGF-Trap对于肺癌的转移可起到抑制作用［26］。

基质金属蛋白酶-2(MMP-2)抑制剂在肺癌血管生成中，由MMP-2介导的VEGF表达发挥着重要作用，MMP-2抑制剂可能成为1种新的肺癌治疗药物。Chetty等［27］研究表明，针对MMP-2的RNAi可能会破坏VEGF引起的肺癌血管生成，而加入过量MMP-2后又会恢复血管生成作用。抑制MMP-2的转录可通过PI3K/AKT途径使VEGF和HIF-1a表达量下降，从而降低了其血管生成的功能。

2.4.2 VEGFR靶向药物 IMC-1C11(VEGFR-2单克隆抗体)由于VEGF浓度不一，针对VEGF的治疗比较困难，而VEGFR的数量有限且易被饱和，所以有研究者认为针对VEGFR的靶向治疗更为有效。IMC-1C11是1种人鼠嵌合型抗KDR抗体IgG1，能够抑制 VEGF与 VEGFR-2结合，阻断 VEGF诱导的KDR和MAPK的p42与p44磷酸化，从而起到抑制血管生成作用。而对于可溶性抗体来说，VEGFR抗体IMC-1C11在理论上更有优势，因为可溶性抗体的过量表达常常导致治疗抵抗性的出现。

肿瘤细胞增殖和调控血管生成的信号通路十分复杂，仅仅阻断其中一个位点可能会导致其他信号通路的反馈性上调，从而使得肿瘤生长再次失去控制。因此，NSCLC多靶点作用的药物，正成为新的研究热点。包括VEGFR和表皮生长因子受体(EGFR)信号通路的多靶点作用药物最近已经进入临床试验阶段，它们通过抑制酪氨酸激酶(TKI)同时作用于两条通路。其中包 括 sorafenib、sunitinib、Vandetanib /ZD6474、Cediranib /AZD2171、axitinib 等。

Vandetanib(凡德他尼)联合标准化疗应用于非小细胞肺癌的治疗，观察到了患者无进展生存时间的延长，而且没有发现颅内出血或者致死性咯血等严重副作用。最新结束的TKI制剂的Ⅲ期临床试验证明，Vandetanib联合标准化疗可以延长无进展存活期，但是总生存时间没有明显改善［28］。但有研究者指出患者分类、临床特征及分子预测物等在凡德他尼治疗非小细胞肺癌的进一步发展中是非常重要的［29］。

Sorafenib(索拉非尼)、sunitinib(舒尼替尼)在非小细胞肺癌治疗方面亦取得了较好的进展。多项Ⅱ期临床研究显示增高了应答率、无进展生存时间。

在已经研究的人类肿瘤中，大约1/2的肿瘤细胞可表达VEGF-C，如甲状腺癌、前列腺癌、胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌等。VEGF-C不仅可以通过与VEGFR-2结合诱导肿瘤血管生成，还可以通过与VEGFR-3结合诱导肿瘤外周形成新的淋巴血管，促进肿瘤细胞通过淋巴血管转移到淋巴结。同时VEGF-C还促进肿瘤生长，在肿瘤细胞脱离基质、到达转移部位时抑制凋亡。这就使得VEGF-C有望成为抑制肿瘤生长转移以及治疗肿瘤的一个新的理想靶点，其信号转导通路上信号的封锁对肿瘤患者而言是很有前途的治疗方法。实际上，针对细胞血管生成的治疗业已经成为肿瘤治疗的一个热点。然而，虽然以VEGF-C为靶点的治疗前景诱人，但也要慎重考虑。由于VEGF-C对于维持正常的血管生成以及淋巴系统功能是必须的，在应用VEGF-C抗体进行治疗的时候就很有可能增加患者发生淋巴水肿的危险。抑制新生淋巴管生成是否会成为抑制肿瘤细胞生长转移切实可行的治疗方案，还需要在大量基础及临床的实验研究中找到答案。

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