参芎注射液对脑缺血再灌注损伤小鼠记忆损伤的保护作用

河南省上蔡县人民医院（463800）李国选

参芎葡萄糖注射液是丹参素、川芎嗪复合制剂，丹参素、川芎嗪为传统的活血化淤中药提取物[1][2]。既往研究表明参芎注射液可有效改善脑梗死大鼠血液粘滞状态、抑制炎症反应、抑制血小板聚集、减少氧自由基的产生、下调Caspase-3等表达、上调BCL-2表达，从而发挥抑制细胞凋亡和抗炎的作用[3][4]。

近年来的研究发现，脑缺血事件的发生往往伴有神经行为学与学习记忆能力的异常，而神经递质兴奋性氨基酸和及其相应受体与学习记忆的关系非常密切，但参芎注射液改善缺血诱导的学习记忆损伤作用是否与其脑内神经递质有关，目前还未见报道。本研究试图用重复脑缺血再灌注建立学习记忆损伤的小鼠模型，从神经递质方面探究参芎注射液对缺血诱导小鼠记忆损伤的保护作用，为阐明参芎注射液抗脑缺血的脑内机制提供进一步的实验依据。

1 材料

1.1 实验动物 实验用ICR雄性小鼠，90只，购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司[中国上海，合格证号SCXK（沪）2008-0016]，购入时体重18～22g，8只/笼饲养，12/12小时光/暗周期调节，室温23±1℃恒温，湿度50～60%，自由进食进水。动物购进后，进行适应性饲养后，方可开始实验，实验时同批体重范围不超过2g。

1.2 实验试剂与药物 2%戊巴比妥钠；参芎葡萄糖注射液（佰塞通）：上海景峰制药有限公司，每100ml含丹参素20mg、川芎嗪100mg。

1.3 主要仪器设备 小鼠跳台仪，Morri水迷宫（中国医学科学院药物研究所）；被动回避反应箱；LC-6A高效液相色谱仪和RF-530荧光检测仪（日本岛津）；TG328A型电子分析天平GL-20A型高速冷冻离心机（湘仪总厂离心机厂）。

2 方法

2.1 动物分组与给药 健康雄性小鼠随机分5组：假手术组（12只）、缺血模型组（11只）、参芎注射液高剂量组（12只，80mg/kg）、参芎注射液中剂量组（13只，40mg/kg）、参芎注射液低剂量组（12只，20mg/kg）。参芎注射液治疗组分别腹腔注射不同剂量的参芎注射液，连续给药7d。模型组和假手术组在相同时间点注射等量生理盐水。第7d给药后30min 做缺血再灌注手术，术后第2～7d进行行为学检测，期间继续给药。

2.2 动物模型的制备 2%戊巴比妥钠腹腔注射（40mg/kg）麻醉后，将小鼠仰卧固定，切开颈部皮肤，分离两侧颈总动脉，用无创动脉夹阻断两侧血流造成前脑缺血，8min后松开动脉夹恢复血流即为再灌注，10min后再次阻断血流，缺血8min后松开动脉夹，实行再灌注，并缝合颈部皮肤。出现心跳加快，呼吸幅度加深，频率先加快、后减慢典型生理变化过程的小鼠，作为缺血成功样本入选。对照组行假手术，即分离两侧颈总动脉但不阻断血流。

2.3 自发活动观察 术后第2d进行。实验时，环境保持绝对安静，室温20～24℃，湿度50～70%，光照度800～1200LUX，抓拿动物及给药时，动作轻柔，尽量减少外部刺激给动物带来的精神状况和情绪的不良反应，并将小鼠预先在环境中适应30min，将其放入自发活动箱中活动1h，观察记录运动轨迹，用计算机系统进行分析。

2.4 跳台试验的观察 术后第2～3d进行。测试装置为被动回避反应箱，先让小鼠在反应箱内铜栅上（未通电）适应环境3min，然后给铜栅充电，动物由台上跳下后，受到电刺激后产生痛觉，会立即跳回平台以回避电击，如此连续训练10min，记录训练过程中错误次数（动物下台受到电击的次数）及10min内受到电击的总时间，作为学习成绩。24h后，将动物再次置于台上，以同样方式考察记忆保持。记录动物第一次跳下平台的潜伏期及10min内的错误次数和受到电击的总时间，作为记忆结果。

2.5 空间学习记忆的测试 空间学习记忆的训练与测试参照Morris水迷宫法[5]，术后第4d进行。水迷宫是一个直径为90cm，高为45cm的黑色圆形水池，池内水深25cm，水温（27±1）℃，一个8cm×8cm 透明玻璃制成的逃避平台固定在水面下1cm处。训练时把小鼠面向池壁放入水中，记录小鼠找到平台的时间，即潜伏期。小鼠在平台上停留30s后，放回饲养笼内休息30min，然后进行下一次训练，每次在不同象限将小鼠面向池壁放入水中。如果小鼠在90s内找不到平台，就人为把小鼠放到平台上停留30s，这时找到平台的时间记录为90s。每天连续训练4次，并取4次的平均值作为当天的成绩。以上训练为期3d，作为学习成绩。

训练时小鼠找到逃避平台所用时间越少，表明其学习记忆能力越强。术后第7d进行测试，作为记忆能力的测试。

2.6 脑组织谷氨酸含量检测 实验第8d将实验小鼠迅速断头，快速取出脑皮质、双侧海马（置于冰块上），新鲜脑组织洗净血液，擦干，称质量后倒入Ependof管中加入0.1mol/L盐酸（HCl）在冰浴下超声粉碎细胞，制成匀浆，12000r/min离心10min。匀浆后离心取上清液200μL，加入衍生剂DNFB，于70℃恒温水浴中衍生20min，加磷酸盐缓冲液至1ml，高速离心15000r/min，10min，取上清液进样。色谱条件：流动相为醋酸钠缓冲液，乙腈；流速为1ml/min；波长为360nm；柱温为35℃；满标吸光度（AUFS）：0.01。

总之，参芎注射液能减轻缺血再灌注引起的脑损伤，改善小鼠学习记忆能力，该作用可能与其提高脑组织谷氨酸含量有关。