生物钟基因NPAS2的研究进展

吴 超，杨盛力，赵志辉

(华中科技大学同济医学院，武汉430077)

生物钟为生物体内一种内在的生物节律，是地球上的生物为适应自然环境在进化过程中形成的，在分子水平上受到CLOCK、BMAL1(brain and muscle ARNT-like protein 1)、Per1、Per2、Per3、Cry1、Cry2、NPAS2、CKIε、Tim、Rev-Erb、DEC 等多个生物钟基因(Circadian Gene)的精确调控［1］。NPAS2(neuronal PASdomain protein 2)又名 MOP4，是机体维持正常生物节律所必需的基因，参与生物钟的调控，并在细胞生长、分化凋亡、肿瘤生长抑制等诸多方面发挥重要作用，可能是一种新的抑癌基因［2］。当其突变或缺失后，会引起节律系统的紊乱。本文综合目前国内外的研究报道，对NPAS2的研究现状作一综述。

1 NPAS2的结构

NPAS2最早由Zhou等［3］于1996年研究小鼠大脑早期发育时发现，是目前发现的人类最大的生物钟基因，其相对分子质量约176．68 kb，同生物钟基因中的Clock(Circadian Locomotor Output Cycles Kaput)基因具有同源性，同属于转录调节因子bHLHPAS(Basical helix-loop-helix-PASfamily，碱性螺旋—环—螺旋/PAS结构域)转录因子家族［3］。编码NPAS2的基因定位于人类染色体2p11．2～2q13上，通过基因对比发现人类与小鼠的NPAS2基因具有同源性。在NPAS2多肽链的N端由bHLH和两个PAS结构域(PAS-A，PAS-B)组成，bHLH能介导蛋白质—蛋白质相互作用，促进蛋白二聚体的形成。研究发现bHLH结构域中有18个序列一致的氨基酸，NPAS2中的bHLH结构域包含这18个氨基酸中的9个。紧随bHLH其后的是由PAS-A和PAS-B两个半保留复制区组成的PAS结构域，PAS结构域长约260个氨基酸，包含约60个重复的氨基酸，能介导与DNA的结合［4］。NPAS2的C端则是核受体连接区，负责与调节NPAS2的相关核受体结合［3］。

NPAS2的同源类似物有 NPAS1、NPAS3和NPAS4，其中NPAS1定位于人类染色体19q13．2 ～q13．3上，结构上亦具有一个 bHLH-PAS结构域，NPAS1的bHLH结构域具有18个序列一致氨基酸中的 17个［3］。NPAS3和 NPAS1拥有 50．2%的相同氨基酸序列，与其他的bHLH-PAS转录因子家族成员的相似性较小［5］。NPAS4亦同属于bHLH-PAS转录因子家族［6］。

2 NPAS2的表达与分布

NPAS2在人体中广泛表达分布，研究已证实NPAS2不仅存在于最早被发现的大脑中，在除睾丸之外的人体所有周围组织中几乎均有表达分布，在中枢系统主要分布于生物节律中心—视神经交叉核，并在人前脑分布广泛［7～9］。

人体生物节律形成有赖于NPAS2的正常表达，研究发现当NPAS2异常表达时，与昼夜节律性相关的疾病如高血压、代谢综合征、肿瘤、心脑血管疾病等发病率可能增加［10，11］。Englund 等［11］研究认为生物钟基因的异常表达可能是代谢综合征的危险因素之一，并指出 NPAS2及其异构体 NPAS-rs11541353与高血压的发生发展相关，而其等位基因是高血压发生的保护因素。Bruder-Nascimento等研究发现NPAS2的表达还可能与性成熟和细胞周期调节相关［12］，同时 Kovanen 等［13］亦发现 NPAS2与人的生育周期和机体季节性变化相关。

此外，研究发现NPAS2在肿瘤组织中存在异常表达。NPAS2的高表达能提高乳腺癌患者生存率，与乳腺癌的预后相关，Yi等通过提取乳腺癌组织中DNA，采用TaqMan等位基因分析方法分析NPAS2基因型，并做了与临床病理结果的相关性研究发现NPAS2的高表达与患者无瘤生存和总体生存率紧密相关，提出NPAS2有望成为一项新的判断乳腺癌预后的敏感指标［2］。2007年Zhu等研究发现，有功能的NPAS2能改善非霍奇金淋巴瘤致病敏感性，NPAS2有可能成为NHL新的一种肿瘤标志物［14］。Zhu等［15］在检测了其他十余个生物钟基因后对比发现与前列腺癌发生关系最密切的就是NPAS2。

3 NPAS2表达的调节

3．1 维甲酸相关孤儿受体调节因子调节NPAS2表达 Takeda等［16］证实维甲酸相关孤儿受体 γ(RORγ)能在体内直接调节NPAS2蛋白结构域的转录表达。RORγ因子缺乏能显著降低NPAS2 mRNA表达的峰值，但不会影响NPAS2对生物节律的调节。并且证实NPAS2依赖的RORγ激活方式是通过在其近端启动子上结合两个ROREs反应元件启动其转录。相反的，过表达的RORγ在肝癌(Hepa1-6)细胞系中能极大地诱导NPAS2表达，从而上调其功能。另外，孤核受体编码蛋白REV-ERB-α能抑制NPAS2表达。研究发现REV-ERB-α能与NPAS2和CLOCK以激素依赖性的方式结合，抑制NPAS2/BMAL1异二聚体的表达［17］。RORs和 REV-ERBs能竞争性地与BMAL1启动子结合并抑制BMAL1的表达。实验中发现这一抑制过程亦可通过REVErbα和另外ROR反相激动剂(如T0901317)的共表达来实现［16］。

3．2 一氧化碳(CO)和NAD(P)H调节NPAS2表达 Uchida等［18］研究发现在 CO缺乏的情况下，NPAS2容易与BMAL1形成异源二聚体，而在CO存在下，促进NPAS2/BMAL1与靶DNA的解离。NAD(P)H能增加NPAS2/BMAL1异源二聚体与靶DNA的结合，促进其表达。另外，Dioum等［19］认为NPAS2表达有可能受到气体反应性转录因子的调节。并推测NPAS2/BMAL1异二聚体与其靶基因的表达受到血红素基传感器上的气体调控。他们通过比较在不同CO浓度下NPAS2异聚体与DNA的结合情况发现，在低摩尔浓度下抑制holo-NPAS2与目的DNA的结合，而apo-NPAS2结合活性不变，当暴露于高浓度CO环境中时，不能形成NPAS2/BMAL1异聚体，而是形成无活性的BMAL1同型二聚体，从而使NPAS2的表达下调。

3．3 Per与Cry蛋白形成异源性二聚体调节NPAS2表达 McNamara等［20］发现Per与Cry蛋白能形成异源性二聚体来抑制CLOCK/BMAL1(或NPAS2/BMAL1)的活性来抑制NPAS2的效应反馈回路。其抑制方式是作为负性元件与NPAS2/BMAL1直接结合并抑制其活性，阻遏Per1-3和Cry1-2的转录，进而使其表达下调。同时，Reick等［7］认为Cry1可能是NPAS2/BMAL1转录因子的特异性抑制因子。Cry介导的转录阻遏的可能原因之一是降低了CLOCK或BMAL1的磷酸化［21］。Cry1因子有可能在提高内源性Cry1水平的情况下来对抗NPAS/BMAL1异二聚体的作用。而实验亦证实 NPAS/BMAL1异二聚体能对抗Cry1的转录激活，对于未参与生物节律控制基因，Cry1对其的启动子无抑制作用。

4 NPAS2的主要功能

4．1 调节生物节律 NPAS2与 BMAL1形成的NPAS/BMAL1异二聚体与靶基因启动子E-box结合，能够调控另外两个生物钟基因Per和Cry的表达，起到调节生物钟节律的作用［20］。因此NPAS2可能是机体维持正常生物节律所必需的基因，当其突变或缺失后，会引起生物节律系统的紊乱。CLOCK和NPAS2的同源性造成了二者之间功能上的相似性和重叠性，Crumbley等［22］发现缺少BMAL1的小鼠完全丧失了昼夜节律，而CLOCK突变的个体却并不表现出严重的症状，这可能正是由于CLOCK的同源类似物NPAS2代替其作用造成的。他们将NPAS2基因敲除的小鼠同CLOCK和NPAS2同时敲除的小鼠比较，后者更明显的丧失昼夜节律性，由此推断二者在生物节律调节上有角色重叠。

Bertolucci等［23］研究发现NPAS2能够在外周体液系统中、外周血管中发挥节律作用［18］。将小鼠的前脑细胞置于完全黑暗中持续培养72 h后，NPAS2/BMAL1异二聚体控制的生物钟基因能持续表达并表现出节律性。同时NPAS2在血管系统中显示一个强劲的周期性表达模式，并能转换Per2的震荡频率，由此间接证明了在外周血管中分子时钟的存在。另外，Turek等［24］研究发现，NPAS2与CLOCK在中枢生物钟功能上的角色重叠可能是二者存在竞争作用，但是在外周系统中这种竞争尚未发现。

4．2 参与肿瘤发生、发展 肿瘤发生涉及细胞的损伤、凋亡、DNA损伤修复等过程，NPAS2基因可能与这些过程相关。NPAS2能够通过对肿瘤相关的生物学通道来影响肿瘤的形成和生长，而且NPAS2还参与DNA损伤修复反应［2］。NPAS2与细胞损伤、凋亡有关的热休克蛋白90(HSP90)与多环芳香烃(AH)受体作用的发挥相关［3］。AH受体是由其第二位的bHLHPAS结构发挥最关键作用，而NPAS2中与缺氧诱导因子(HIF)和内皮细胞PAS结构域蛋白(EPAS)1中类似的bHLH-PAS结构域可能激活哺乳动物基因响应缺氧的表达，这可能与细胞的缺氧损伤、凋亡相关。

Aaron等［25］通过细胞培养研究发现NPAS2能够影响细胞周期变化。他们发现经诱变剂处理后，具有正常NPAS2的细胞更多停留于G1或G2期，S期细胞减少，而G期正是DNA损伤修复的关键点，与之对比，NPAS2敲除的细胞周期无明显变化。NPAS2基因敲除后的细胞损伤修复功能会明显下降。他们研究了在MCF-7细胞系中，NPAS2沉默对已证实影响DNA损伤的84个基因表达的影响:与NPAS2表达正常的细胞相比，有74个(91．4%)表达下调，22个(27．2%)下调2倍或更多，只有7个基因表现出表达增加(8．6%)，而其中无显著性差异。

研究发现CLOCK/BMAL1能够调控与细胞周期相关的WEE、c-Myc和CyclinD1等基因的表达。CLOCK/BMAL1能通过结合E-box上的Wee-1启动子激活基因转录。而Cry蛋白的缺失能导致WEE-1表达升高，这可能是由于 Cry蛋白对 CLOCK/BMAL1异聚体阻遏的减弱。WEE-1是细胞周期激酶，在G2-M转换中发挥重要作用。当DNA复制或有DNA损伤时能激活WEE-1，使其细胞失活并使分裂停留在G2-M期。NPAS2与CLOCK的同源性和功能上的重叠，可能使其亦参与了这一细胞损伤修复过程。

Zhu等［26］采用全基因组芯片分析发现，目前已经确定的NPAS2目的基因有16个，其中9个是目前已知与癌症发展相关的基因，包括:CDKN2AIP(p16相关蛋白)、CDC25A(细胞周期调节因子)、ARHGAP29、POU4F2、GNAL、CX3CL1、KDELR1、THRA、ELF4。他们发现在无限增殖的"正常"乳腺上皮细胞系MCF-10A(在无胸腺小鼠中无致瘤性)内，NPAS2基因的沉默对16个目的基因中的14个有重要影响。由于在接近人体正常细胞的MCF-10A细胞系中，NPAS2的沉默对一系列肿瘤基因的影响，更加证明 NPAS2可能是一个抑癌基因，NPAS2功能的缺失可能出现在肿瘤发展的早期过程中。

Kang等［27］通过提取不同时间段的脑组织检测发现，在下午到夜晚时细胞中的DNA损伤修复活性最强，而午夜到清晨段最弱，提示DNA损伤的修复与生物钟基因相关。Per1可通过调控细胞周期基因并与主要的DNA损伤激活的检测点蛋白相互作用而起到抑制肿瘤的作用［28］，而NPAS2能够对Per起调节作用，这从侧面证实NPAS2对肿瘤的抑制调节作用。另有研究发现类风湿关节炎发病的分子过程亦有NPAS2的参与。Kouri等［29］通过免疫组化等方法检测类风湿关节炎患者滑膜中各个生物钟基因的表达发现，ARNTL2和NPAS2是对人体免疫炎症性疾病中影响最大的生物钟基因。

总之，在肿瘤组织中普遍存在生物钟基因的表达异常，生物钟紊乱可能和肿瘤的发生、发展密切相关。生物钟基因NPAS2同肿瘤细胞的增殖、凋亡及损伤修复关系密切，可能是潜在的抑癌基因。深入研究NPAS2以及其他生物钟基因同肿瘤的关系，既能拓展人类对生物钟基因的认识，亦能丰富和完善肿瘤发生、发展机制，还可能为肿瘤的预防和治疗提供新思路。

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