猪繁殖与呼吸综合征研究进展

韦敏，朱林，刘萍，薛敏

（重庆市武隆县畜牧兽医局，重庆武隆 408500）

猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)导致的一种接触性传染病，主要引起猪厌食、体温升高、妊娠母猪早产、晚期流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍和仔猪、育肥猪发生呼吸障碍为特征的一种病毒病，并且能引起较高的死亡率。该病于1987年在美国的北卡罗来纳州首先发现，然后迅速向世界各地蔓延, 目前为止,世界上仅有少数几个国家没有该病的发生与流行，如瑞典、新西兰、澳大利亚等。在此病的发生到传播期间，由于病原不清曾有过许多病名，1991年Wensvoort 等首次分离到该病毒，并命名为 (lelystad virus , LV)，直到1992年，欧共体才将其统一命名为“猪繁殖与呼吸综合征(PRRSV)”。1992年5月，国际动物卫生组织(OIE)已将其列为B级疾病。1996 年郭宝清等首次从国内PRRS血清阳性猪群中分离到PRRSV，从而证实了我国也有此病的流行，近年来该病在我国也呈现了蔓延和流行的态势。目前，PRRS已蔓延至世界所有养猪国家和地区，给养猪业带来巨大损失。因此，人们对其进行了大量科学研究，本文就PRRSV分子生物学、血清学、免疫学以及流行病学方面对其进行进一步阐述，为其防治和疫苗的研制打下基础。

一、病原学及分子生物学方面研究和诊断

从1991年该病毒分离以来，人们对PRRSV进行了多方面的研究，现已明确，PRRSV 属于尼多目动脉炎病毒科动脉炎病毒属，与鼠乳酸脱氢酶病毒(LDV) 马动脉炎病毒(EAV) 和猴出血热病毒(SHFV) 为同一属。由于PRRSV的基因序列存在较大的差异，PRRSV可分为两大类型，即欧洲型(代表毒株:Lelystade株)与美洲型(代表毒株:ATTCVR-2332)，我国分离到得毒株为美洲型，尚未见欧洲型报道。

对PRRSV的分子生物学诊断方法主要有核酸探针杂交技术以及反转录-聚合酶反应(RT-PCR)技术。对于疑似病例可以采取RT-PCR，对提取的病料RNA进行逆转录，可扩增出所需的目的片段，经连接测序分析，提取的为PRRSV的野毒株。RT-PCR检测法具有快速、准确、特异、灵敏且可早期诊断等特点，为病毒检测的常用方法之一。

目前，预防PRRS的方法主要是采用弱毒苗和灭活苗，但是这两种疫苗的安全性都不是很高，存在毒力返强和传播疫苗毒的危险，因此寻找安全、效果可靠、有效的基因工程疫苗迫在眉睫。对于PRRS的ORF1-ORF7的研究及PRRSV感染性克隆的成功构建，通过基因的缺失或替换基因组的某些部分等基因工程技术而研制出安全、高效的基因工程疫苗已以成为可能。另外，PRRSV DNA疫苗研究也取得了较好的效果，将GP5基因克隆到巨细胞病毒(CMV)早期启动子的控制之下构建成真核表达质粒，制备DNA疫苗，免疫仔猪后可诱导产生抗体，实验室攻毒实验结果表明具有良好的保护效果。因此，DNA 疫苗有望成为今后PRRSV疫苗的重点研究方向。

二、血清学方面研究及诊断

最初诊断PRRS最确切的方法是病毒分离。病毒分离时采用的病料最好采用死胎或弱仔猪的心、肝、肺、脑、脾、肾等组织匀浆的混合物。对哺乳仔猪和断奶仔猪最好取肺脏，母猪可取血浆、血清和白细胞，公猪可采取血清和精液，木乃伊胎儿难以分离到病毒。分离PRRSV适用的细胞有猪肺泡巨噬细胞和MARC-145、CL2621、CRL11171等细胞系。细胞培养分离的PRRSV可制成超薄切片，进行电镜观察，观察病毒的形态，以便确诊。

除了常规的细胞培养，电镜观察之外，对PRRS的检测诊断主要采取血清学诊断方法，通常采取的方法有免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)、酶联免疫吸附(ELISA)法、血清中和试验(SN)及其他一些血清学实验。

IPMA法：这是荷兰中央兽医研究所的Wensvoort于1991年率先建立的一种检测PRRSV抗体的方法，实验主要在PAM、CL2621、MA104、MARC-145 细胞上进行。该法敏感性、特异性都较好，可用于PRRSV 的抗原检测、病毒鉴定及血清抗体检测等，能在感染后6 d的血清中检测到抗体。但是本实验也有其缺点，即由于实验判定的主观性较强,不利于自动化操作，不适于大规模普查。

ELISA法：此法主要用于检测PRRSV抗体，Albina等用PRRSV接种PAM培养，制备阳性抗原，并用相同的方法制备模拟抗原，首次建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA。通过实验比较发现，ELISA检测方法的敏感性和特异性较好，且抗原用量少，节省材料，不需要特殊仪器，快速、经济及敏感，结果便于长期保存等优点，明显优于其他检测方法。鉴于此，已有许多国家将本法列为常规诊断方法，且有相应的试剂盒可供使用。

SN法：该法主要用于检测PRRSV抗体，用MARC-145细胞在96孔微量板上进行。由于传统的中和实验不能检测出急性感染期抗体，还需要加入双份的血清。Yoon和Takikawa等在血清和病毒混合液中加入补体, 提高了反应的敏感性, 可在PRRSV 感染早期作出诊断。

还有其他一些血清学实验，如用于检测感染组织中PRRSV 抗原的免疫胶体金技术、亲和素-生物素免疫过氧化物酶试验、间接荧光抗体技术(IFA)等。

三、免疫学方面研究及诊断技术

PRRSV的免疫学特性和免疫抑制机理的研究受到国内外学者的关注。PRRSV可诱导机体产生全身性体液免疫应答，在感染第七天，可采用ELISA法检测出PRRSV的特异性抗体IgG和IgM，采用Western blot可检出抗核衣壳N蛋白特异性抗体；感染第9～35天可检出抗内膜蛋白M和抗E蛋白抗体。有研究证据表明，E蛋白和M蛋白在病毒中和作用中极为重要。

PRRS是一种病毒病，目前尚无特效的治疗药物，控制该病的发生和传播的主要措施仍然是疫苗的免疫接种。在地方流行性区域给动物接种疫苗，对于预防繁殖障碍比较有效；Rogan等研究表明，用PRRS灭活苗免疫猪后，可减少猪病毒血症的发生，有效阻止猪肺部病变。但是，通过接种疫苗来控制PRRS仍然存在较多的问题。灭活苗和弱毒苗虽然都能减轻临床症状，但是不能阻止病毒的再次感染和病猪的排毒，而且灭活疫苗虽然安全，但是其产生的保护力较弱，需要多次免疫接种；和灭活疫苗相比，弱毒疫苗诱导的免疫反应持续更长、也更有效，但是其本身存在散毒问题，而且有返强的危险，还可能造成疫苗毒的传播，引起PRRS的持续感染和病毒血症的发生；而且，血清学的方法不能检测免疫猪和自然感染猪。据报道，1996年丹麦使用美国的弱毒疫苗后引起了PRRS的大暴发。因此，许多国家现在已经禁止使用弱毒疫苗或限制使用疫苗来控制临床暴发。

随着现代生物学技术的兴起，特别是DNA重组技术的出现，为研制新一代的疫苗提供了崭新的方法。目前利用基因工程技术已经和正在研制开发的新型疫苗主要有亚单位疫苗、活载体疫苗、DNA疫苗、转基因植物可食疫苗、合成肽疫苗、抗独特型疫苗等。对PRRSV基因工程疫苗的研究主要集中在亚单位疫苗、活载体疫苗和DNA疫苗。

（一）亚单位疫苗PRRSV各结构蛋白免疫原性的研究已比较清楚。PRRSV感染猪体后，血清中抗PRRSV的免疫球蛋白主要是针对N蛋白和M蛋白，GP3虽不能刺激中和抗体的产生，但可对仔猪提供保护，GP4、GP5和M蛋白可产生中和抗体，GP5比GP4产生中和抗体的能力更强。亚单位疫苗及其它新型疫苗的研究多针对这些蛋白。

（二）活载体疫苗PRRS的活载体疫苗主要有以伪狂犬病毒和腺病毒为载体来表达PRRSV的抗原基因。因为它避免了PRRS灭活疫苗和弱毒疫苗的缺陷，可同时启动机体的细胞免疫和体液免疫，而且还可构建多价疫苗，因此成为PRRS疫苗的研究热点。

（三）DNA疫苗PRRSV DNA疫苗研究也取得了较好的效果,将GP5基因克隆到巨细胞病毒(CMV)早期启动子的控制之下构建成真核表达质粒,制备DNA疫苗,免疫仔猪后可诱导产生抗体,实验室攻毒实验结果表明具有良好的保护效果。由于DNA 疫苗可同时诱导产生细胞免疫和体液免疫,并且对不同的血清型的毒株具有交叉保护性,有可能克服病毒外壳蛋白变异导致的免疫逃脱现象。因此,DNA疫苗有望成为今后PRRSV 疫苗的重点研究方向。

总之, 目前对于PRRSV病毒已进行了大量的研究，人们对其从分子生物学、血清学及免疫学方面进行了深入的研究，并取得了很大的进展，PRRSV的分类地位已基本确立, 分子结构已逐步明确,单克隆抗体的建立以及各种诊断方法相继问世,疫苗试制成功,使人们对PRRS的认识不断加深,神秘猪病已不再神秘,控制本病也不再是束手无策。但在呼吸及生殖系统病变的病理学机制、病毒与宿主的相互作用、病毒蛋白的结构与功能、病毒的持续感染、分子免疫机制及通用疫苗的研制、PRRSV感染后易感染其他疾病的原因和建立快速、准确、方便的临床诊断方法等方面都还有待进一步深入研究。早日阐明这些机理将对PRRS的预防和控制具有重要的指导意义。