人脐带间充质干细胞移植对小型猪急性心肌梗死模型心肌细胞再生的影响

张 嵬，杨 力，张亚东，李 婷，陈 越，刘晓程

(天津医科大学心血管病临床学院泰达国际心血管病医院，天津 300457)

冠状动脉介入与搭桥术是目前心肌血运重建的主流方法。对于心肌梗死患者，二者能明显改善心肌血供，但无法恢复具有有效收缩功能的心肌细胞数量，亦无法改善心室重构和心力衰竭。近10年来，骨髓间充质干细胞移植用于心肌梗死治疗的研究取得了较大进展，但也发现了这一方法的弊端。脐带间充质干细胞是一种具有自我更新、增殖及多向分化潜能的干细胞，其取材方便、来源广泛、数量充足、免疫原性低、可避免伦理争议，且增殖速度快、分化能力强，应用前景广泛［1］。研究发现，脐带间充质干细胞在体外药物干预后可向心肌细胞分化［2，3］，且在心肌梗死的小动物模型中具有促进心血管组织再生和修复的作用［4，5］。2012 年 3 ～12月，我们观察了人脐带间充质干细胞移植对小型猪急性心肌梗死模型心肌细胞再生的影响，旨在为其临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 CM-Dil(美国 Invitrogen公司);c-TnT鼠抗人单克隆抗体，c-kit鼠抗人单克隆抗体与兔抗人单克隆抗体(美国Lab Vision＆NEOMARKERS公司);vWF兔抗人多克隆抗体(英国Abcam公司);Masson三色法染色试剂盒(福州迈新生物技术有限公司);TUNEL试剂盒(德国Roche公司);广西巴马小型猪(上海甲干生物科技有限公司);经图像分析软件 Image Pro Plus 6.0(美国 Media Cybernetics公司);麻醉机(Detax-Ohmeda 700，美国);心电监护仪(Detax-Ohmeda 700，美国);激光扫描共聚焦荧光显微镜(日本Nikon公司)

1.2 实验方法

1.2.1 脐带间充质干细胞制备 无菌条件下采集脐带标本并剪成1 mm3左右大小的组织块，应用组织块爬片法分离脐带间充质干细胞并成功传代扩增至第5代达108数量级，流式细胞仪检测细胞表型，实验前采用CM-Dil标记。

1.2.2 急性心肌梗死模型制作及干预 23只广西巴马小型猪(体质量20～25 kg)经肌注盐酸赛拉嗪3 mg/kg与静注丙泊酚20 mg诱导麻醉。气管插管，呼吸机辅助通气，潮气量350 mL，15次/min，氧流量1 L/min。术中1% ～2%异氟烷吸入、丙泊酚2 mg/(kg·h)静脉持续泵入维持麻醉，持续心电监护。胸骨正中切口暴露心脏，缺血预适应3次后(5 min/次)结扎冠状动脉前降支中、远端1/3交界处。7只结扎冠状动脉后出现室颤，予电除颤后2只存活，5只死亡。心电图及核素心肌灌注显像确定18只心肌梗死模型制作成功。将18只造模猪随机分为对照组、PBS组和移植组，每组6只。移植组釆用微量注射器将备好的标记CM-Dil的脐带间充质干细胞悬液(2 mL，1×107细胞/mL)经心外膜呈矩阵分布多点注入梗死组织(每点注入0.2 mL)。PBS组以同样方法注入等量PBS。对照组只造模不干预。术后3组均肌注青霉素160万U，2次/d，连续3 d。

1.2.3 观察项目

1.2.3.1 心肌灌注情况 模型建立后即刻和干预后6周行梗死区心肌灌注核素显像:耳缘静脉注射14.8 MBq/kg 99m锝—甲氧基异丁基异腈，给药30 min后行心电门控心肌灌注核素显像。仪器为GE Millennium VG-5，配低能通用型准直器，2个探头呈90°夹角，绕心脏旋转 180°，每帧釆集 25 s，共釆集30帧，矩阵64×64，放大倍数2.0，釆用滤波反投影重建原始图像。通过Emory Cardiac Toolbox软件量化灌注质量缺损百分率(MDP)及左室射血分数(LVEF)。以治疗后与治疗前灌注质量缺损百分率的差值 (ΔMDP)评价灌注情况，LVEF的差值(ΔLVEF)评价心脏功能。

1.2.3.2 干细胞存活、分化及增殖情况 采用免疫荧光技术分析。术后6周静脉注射1 g KCl处死动物，取心肌梗死及交界区组织，制作冰冻切片。采用荧光显微镜观察所标记的荧光细胞(即干细胞)。组织切片分别以c-kit、c-TnT、vWF抗体作为一抗标记，采用FITC标记的抗兔二抗和Cy5标记的抗小鼠二抗对切片进行复染。采用IPP图像处理软件对图像进行叠加分析。

1.2.3.3 心肌细胞存活与凋亡情况 术后6周静脉注射1 g KCl处死动物，取心肌梗死及交界区组织，福尔马林固定后行石蜡切片。以Masson三色法检测存活心肌，以TUNEL法检测细胞凋亡情况。采用IPP图像处理软件对图像进行分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件。数据以表示。采用多个样本单因素方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 心肌灌注情况 移植组、对照组、PBS组ΔMDP分别为 -0.83% ±1.17%、4.33% ±1.86%、3.67% ±1.21%。移植组低于对照组及PBS组(P均＜0.01)。移植组、对照组、PBS组 ΔLVEF分别为1.00% ±3.22%、-9.17 ±2.48%、-9.33 ±2.73%，移植组低于对照组及PBS组(P均＜0.01)。

2.2 干细胞存活、分化及增殖情况 移植6周后移植组梗死交界区域内可见CM-Dil阳性细胞。c-TnT与vWF染色中部分细胞呈阳性。除外源性植入的脐带间充质干细胞外，梗死区域内尚发现CM-Dil阴性而c-kit染色呈阳性的细胞，部分细胞c-TnT与vWF染色亦呈阳性。

2.3 心肌细胞存活与凋亡情况 Masson三色法染色结果应用IPP软件量化分析，移植组、对照组、PBS组心肌细胞存活量分别为(31391±4794)、(31520±4164)、(72271 ±4844)IOD/hpf。移植组明显多于对照组及PBS组，P均＜0.01;即移植组交界区域存活心肌细胞明显增多，对应的纤维组织明显减少。TUNEL染色结果发现移植组心肌细胞凋亡数为(40±4)个cell/hpf，明显少于对照组和PBS组的(82±5)和(79±5)个 cell/hpf，P均 ＜0.01。

3 讨论

虽然冠状动脉介入与搭桥术对急性心梗的治疗效果良好，但术后常出现病理性心室重塑进而引发心力衰竭，且迄今没有有效的治疗措施，甚至需通过器官移植才能恢复心脏功能［6，7］。分析其原因，主要是具有收缩功能的心肌细胞与营养心肌细胞的冠脉循环绝对不足。目前研究的目标是找到适宜方法以替代心肌梗死细胞，预防或逆转病理性心脏重塑。心血管再生医学与干细胞疗法成为当前最具吸引力和前途的方法［8］。

间充质干细胞是中胚层来源的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞，广泛存在于全身多种组织中。骨髓间充质干细胞是最早被分离出并被广泛用于治疗缺血性心脏病研究的成体干细胞。多项临床前的大动物实验研究均证实骨髓间充质干细胞能够成功植入并分化为心肌和血管内皮细胞［9～12］;亦能激活心肌干细胞生成新的心肌与血管结构［13，14］。但随着年龄增长，骨髓干细胞功能及生长、分化能力降低，端粒明显变短［15］;加上抽吸骨髓为有创性操作、骨髓供体有限，均限制了同种异体骨髓干细胞的应用［16］。相对于骨髓干细胞，脐带间充质干细胞具有取材简便、组织来源丰富、细胞原始、增殖能力强、分化潜能大、免疫原性低、不诱发畸胎瘤、无病毒感染风险及伦理问题等优点，是骨髓间充质干细胞的理想替代物［1］。

何红燕等［3］将用BrdU标记的人脐带间充质干细胞移植至心肌梗死的大鼠心肌，2周后发现，移植细胞仍存活，且能表达心肌细胞标记物心脏肌钙蛋白I和T。Wu等［4］在体外试验和大鼠心梗模型中再次证实了脐带间充质干细胞能向心肌细胞分化，超声提示移植后2周和4周的左室功能较对照组改善。Latifpour等［5］观察到，结扎 LAD 后30 d，接受人脐带间充质干细胞治疗的家兔的左室射血分数和短轴缩短率明显改善，瘢痕含量显著减低;组织病理学分析显示，邻近和远离梗死区域的植入细胞表达肌钙蛋白I、actin和connexin-43，在梗死区内亦可见少数移植的细胞。

本研究结果显示，脐带间充质干细胞植入小型猪急性梗死心肌后6周仍然存活，其中部分干细胞分化为心肌细胞和血管内皮细胞。与其他两组相比，移植组心肌缺血区域内亦存在较多的CM-Dil阴性、c-kit阳性的心肌干细胞(CSCs)。在外源性干细胞的刺激下，CSCs在缺血区域募集并部分分化为新生的心肌细胞与血管内皮细胞，证实脐带间充质干细胞可能通过外源性和内源性再生两个方面的机制参与心梗后损伤的修复，新生的心肌细胞可部分取代梗死细胞而发挥组织修复功能。

研究证实，间充质干细胞的旁分泌机制对心梗后损伤的修复亦具有重要作用。有学者对脐带和骨髓间充质干细胞的生长因子分泌谱进行了比较，发现脐带间充质干细胞可更强地表达数种直接或间接地与血管生成有关的生长因子，如血管内皮生长因子-D(VEGF-D)、血小板衍生的生长因子(PDGFAA)、转化生长因子-β2(TGF-β2)、碱性成纤维生长因子(bFGF)和肝细胞生长因子(HGF)［17］。提示脐带间充质干细胞可能更适用于治疗缺血性病变。鉴于HGF和bFGF被报道具有抗纤维化的作用［18］，因此提示脐带间充质干细胞可用于预防或减轻纤维化。本研究结果亦证实了上述观点。

本研究结果提示，人脐带间充质干细胞经体外培养扩增后经心外膜直接注射植入，可在小型猪心梗模型的心肌梗死区域部分存活并分化为心肌和血管组织;人脐带间充质干细胞可促进固有心肌干细胞的募集和分化，减少细胞凋亡和组织纤维化，抑制心室重塑的发生，改善梗死区域的心肌灌注和心室功能。

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