ELISA法检测的影响因素及其对策

2013-04-07谭立明

实验与检验医学 2013年4期

谭立明

(南昌大学第二附属医院检验科,江西南昌330006)

酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是一种特殊的试剂分析方法，在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术，其试剂易于保存、结果判断较为客观，是目前实验室检测抗原抗体最经济、最普遍的试验诊断方法。其原理是将抗原(抗体)结合到固相载体表面，再将待测抗体(抗原)、酶标抗原(抗体)与固相抗原(抗体)结合形成免疫复合物，经洗涤使免疫复合物与待测抗体(抗原)呈比例，加入酶反应底物使其与固相上的酶反应变色，根据颜色做定性或定量分析，得出检测结果[1-3]。ELISA法步骤包括标本的采集、保存、加样、温育、洗板、显色、比色以及结果判断[4]，临床采集待检样本过程中常出现溶血、黄疸、脂浊，类风湿因子、高浓度非特异性免疫球蛋白、药物及血液抗凝剂等亦对结果产生一定影响[5]。虽然操作简单，但还是需要注意一些因素的影响[6-8]，试剂的选择、正确的操作、优良的仪器都与检测结果密切相关。本文根据样本的影响因素及操作流程中可能出现的相关问题展开笔述，对ELISA法检测的影响因素及相应对策作一综述，希望提高ELISA法检测的准确性。

1 样本的影响因素

临床采取空腹抽取静脉血清作为ELISA检测标本，标本采集过程中很多因素可能导致检测结果不准确，如溶血、脂浊、类风湿因子、甲胎蛋白、高浓度非特异性免疫球蛋白、药物、血液抗凝剂及细菌污染等。

1.1 溶血溶血时红细胞破裂释放出具有过氧化物酶活性的物质干扰试验结果出现假阳性，孙辉等[9-11]通过实验报道样品溶血血红蛋白浓度不大于4.95g/L，对双抗原夹心法、间接法、竞争法、捕获法检测结果均无影响。徐传国[12]认为溶血易导致弱阳性标本漏检，黎学东等[13，14]认为虽然溶血会对HB-sAg检测造成假阳性影响，但是小于8g/L时可以检测；王红等[15，16]使用不同的干扰物浓度及分析方法得出结论，随着溶血程度的增高HBsAg检测OD值有轻微增高趋势；但是溶血检测抗-HIV无影响[17]。

临床工作中无法采集到无干扰物血清或因操作因素导致标本出现溶血时，评估标本干扰物含量及标本处理情况，在有效范围内进行ELISA检测，对于溶血标本可先测定血浆Hb含量，不大于5g/L时可用于HBsAg的检测，超过此范围的阳性标本最好做复检，避免假阳性结果发生[18]。目前也有通过增设试验孔的方法来处理轻度甚至重度溶血标本的检测，使溶血造成的假阳性结果得到纠正，且有非常显著性统计学意义。

1.2 脂浊孙辉等[9]通过实验报道乳糜样品含福尔马肼浊度小于1460FTU的乳糜时，对双抗原夹心法、间接法、竞争法、捕获法的检测结果均无影响。汪建国等[16]认为脂质颗粒会黏附在反应孔内壁，使吸光度A值增高出现假阳性；徐学新等[19，20]认为不同程度的乳糜血液随着放置时间的延长OD值下降，导致不同程度的漏检。虽然可采取高速离心的方法可将乳糜微粒去除，此过程可能对检测结果带来影响，然而盲目采取高速离心等方法试图去除干扰物并不可取。

1.3 黄疸结合胆红素浓度不大于344μmol/L对双抗原夹心法、间接法、竞争法、捕获法的检测结果均无影响，超过浓度的样本应重新采集，对于黄疸病人为保证检测结果的可靠性可选择其他检测方法。

1.4 类风湿因子在类风湿患者及健康者血清中常含有类风湿因子 (RF)，RF为一种抗人或动物变性免疫球蛋白IgG的自身抗体，与IgG分子Fc片段抗原决定簇结合，常见的有IgM、IgA、IgG、IgE型，均能与变性IgG抗体产生非特异性结合，在ELISA检测抗原的试剂盒中，RF可与固相包被的表面抗体的Fc片段及酶标记物中免疫球蛋白结合。研究[20]表明高浓度的类风湿因子可引起ELISA检测抗原检测出现假阳性结果，类风湿因子可与固相上包被的特异性抗体IgG及随后加入的酶标特异性抗体IgG结合出现假阳性结果[21]。穆海霞等[22，23]研究报道高浓度 RF(＞500IU/ml)对 ELISA 检测HBsAg产生假阳性结果较明显，且与RF浓度无显著相关性。

在临床工作中，若出现乙肝两对半少见模式，如仅HBsAg阳性，应结合患者病史并采用其他方法如微粒子酶免疫法进行复检，慎重报告。

1.5 抗体、补体人类血清中含有天然异嗜性抗体，而异嗜性抗体可通过交联固相和酶标的单抗或多抗产生假阳性结果。来自哺乳动物的固相抗体及酶标二抗可激活人体补体系统，在反应过程中抗体分子结构发生变化，暴露补体的结合位点，产生假阳性结果，也可能固相抗体因为活化补体的结合导致抗原抗体的表位结合能力下降，出现假阴性结果。研究报道[23]高浓度的乙型肝炎表面抗体会引起HBsAg检测出现假阴性结果，临床需注意避免携带污染造成检测结果错误。

1.6 血液保存液志愿者献血一直是各医院血站血液的主要来源方式，低浓度标本的检测对输血安全至关重要，按照《献血者健康体检要求》和《血站实验室质量管理规范》，献血者需检测抗-HIV、抗-HCV、HBsAg、梅毒抗体等，且必须建立初次有反应标本的复检程序，常采用抗凝试管血和采血导管血同时复检，然而不规范的操作常导致试管标本和末端血袋管混入血液保存液。血液保存液成分、pH值、离子强度等影响均可能导致检测结果错误。血液保存液对ELISA法检测抗-HIV结果影响明显，能明显减低试剂对抗-HIV的检测能力，造成假阴性结果；也有研究报道[24]，血液保存液对HBsAg、梅毒抗体、ALT弱阳性试管标本及血袋管标本检测结果影响有统计学意义，造成弱阳性结果漏检，但对抗-HIV阳性结果检测无影响；张桂芳等[25]通过实验证明抗凝剂对HIV阴性抗体检测结果无影响，但是当抗凝剂高于5mg/ml时对HIV阳性测定造成明显负干扰，同时也影响血细胞分析，且同一抗凝剂同一浓度对不同公司的试剂检测HIV抗体影响也不相同。

血液保存液是必须使用的，可以通过以下方法避免血液保存液带来的不良后果：完善标本留样确认程序，确保标本与血袋同源，采用试管标本代替血袋标本，避免从血袋导管采取复检标本；采用新型留样血袋，附带留样试管，将最初采集时未混入血液保存液的血液用于检测；规范血液留样操作，防止待检标本混入血液保存液，若混入，可将抗-HIV的临界值相应调低。如果使用EDTA-K2做抗凝剂，最好将浓度控制在1.5~2.5mg/ml的范围内，对于较难采集到足够血液样品的患者可采用血细胞分析检测HIV抗体。如采用抗凝血将做检测样本时最好与血清样本进行对比试验，并建议厂家对试剂的干扰能力进行严格的质量控制，说明适合使用的试剂及其相应浓度。

1.7 药物研究表明，高效价乙型肝炎免疫球蛋白可以和HBsAg形成免疫复合物，使HBsAg阳性患者检测呈阴性，出现两对半少见模式；部分HBsAg阴性者接种乙肝疫苗1~2周后血清中可检测到HBsAg，造成HBsAg一过性阳性，所以乙肝疫苗接种后一个月内最好避免做乙肝两对半检查。

1.8 细菌一些细菌的菌体中可能含有内源性过氧化物酶会对使用相应酶做标记的测定方法产生影响，污染细菌可能含有内源性辣根过氧化物酶，使试剂出现非特异性显色造成假阳性而干扰结果。

1.9 样品因素小结综合得出，在正确的时间采集标本并防止污染、避免破坏，在干扰物处于一定浓度范围内(胆红素浓度≤344μmol/L，溶血血红蛋白浓度≤4.95g/L，乳糜样≤1460FTU)进行 ELISA四种方法检测均不影响检测结果，但对竞争法检测HBeAb的影响有统计学意义。对于贫血性溶血、新生儿溶血性黄疸及抽血不当等造成的溶血标本尽量避免二次抽血对病人造成不必要的伤害。

2 操作的影响因素

2.1 试剂的准备试剂的质量如抗原抗体的纯度及亲和力、标记物的比活性、滴度及特异性等直接影响检测结果，为保证检测质量，所有试剂必需经国家食品药品监督管理总局注册批准、批检测合格，临床评估特异性、敏感性、稳定性较高且在有效期内才有使用价值。不同厂家试剂敏感性、特异性不尽相同，有报道不同厂家酶标板孔间A值差大小可达15%，标记酶的活性及显色液的稳定性也相差较大，所以合理有效的试剂选择尤为重要[26]，对ELISA试剂盒应正确选择，定期评价并建立科学的接收标准，结合常规血液筛查情况，对实际的均一性、适用性、稳定性，选出灵敏度、特异度及精密性合适的试剂保证检测结果的准确。有报道[27，28]不同厂家-IgG配制成的抗HCV-cAg酶结合物溶液对检测结果有区别，配制抗HCV-cAg酶结合物溶液前应检测小鼠-IgG与产品的适配性。其次试剂盒的储存方式、运输条件及有效期均为影响检测结果的重要因素，试剂盒一般2~8℃冰箱保存，注意不要紧贴冰箱储存室后壁以防止试剂冻结失效，可避免使用时试剂受温差影响导致酶标板上凝集小水珠及反应出现温差而影响抗原抗体的反应。使用前需将试剂盒放置37℃恒温箱温育30min，且不同厂家、不同批号的试剂不能混合使用。剩余试剂应及时放入干燥剂密封保存在2~8℃冰箱，试剂打开后一周内有效，同时注意做好室内质检，确保实验结果的可靠性。

不同方法学的检验试剂会使乙肝两对半结果出现不同，如临床操作中电化学检测HBsAg呈阳性，而采用ELISA检测则呈阴性，此外，使用单抗或多抗试剂对检测结果同样造成一定的影响。研究表明ELISA检测细胞因子时需要根据检测的细胞因子选择不同的裂解液进行处理，避免裂解液对细胞因子产生影响导致假阴性结果[29，30]。

2.2 样本的采集、保存及预处理标本的运输及保存、检测人员的自身素质均可能对检测结果造成不良影响，为避免出现错误样品应准确标明编号、种类、受检者姓名及采集时间，收集后认真核对，拒收不符合要求的标本及申请单，严格按照拒收制度处理，同时处理合格标本，做好后续工作，避免延误导致标本出现溶血等其它不良情况。标本的预处理对检测结果有非常明显的影响，临床工作中有时为了快速得出检测结果在血液开始凝固前强行离心分离血清，血清中残留的纤维蛋白丝对实验结果造成影响[31]，标本离心需彻底且必须待血液凝固后方能分离血清，也可在标本采集时使用带分离胶的采血管提取[32]，使用未混入保存液的血液做检测标本。在此过程中保证待检标本新鲜、避免细菌污染，否则易出现假阳性结果，若不能及时检测可将分离的血清于4℃保存，超过一周于-20℃保存，避免反复冻融，防止出现假阴性结果[33]。若血清中含有类风湿因子或免疫复合物也将造成假阳性结果。

2.3 加样 ELISA检测加样时应垂直将样本准确加入微孔底部，注意避免吸头碰到酶标板上的包被物，尽量慢吸快放，防止溅出或产生气泡，避免液体外溅使血清残留在反应壁上。每次吸样注意更换吸头，做到一样一吸头，避免交叉污染，干吸头每次加样前在血清中抽吸三次保证吸样准确，滴加试剂时建议先将滴瓶摇匀挤去第一滴再加样。加样前先将微孔板平放在板架台上，以免对洗板机的自动操作带来影响，为了保证加样的准确性，建议使用准确性高的微量移液器且定期进行校正。加样品稀释液、酶结合物应用液、底物应用液及终止液时可采用定量多道加液器，迅速完成加液过程，加样后用不干胶或胶带纸封好酶标板防止水分蒸发或杂物进入孔内，注意封板膜不可二次利用，避免交叉污染，剩余的微孔板、不干胶或胶带纸与干燥剂一同保存在备用自封塑料袋中。大批量检测大型机构体检标本时可采用直接加入适量血清的加样模式，经济环保提高工作效率[34]。

在实际操作过程中，待检标本和酶标志物先后顺序加入，于是在竞争法中因为两者的不同时加入而存在一个“不公平”竞争现象，研究表明，竞争法ELISA检测受加样方法的影响存在统计学意义[35]，将标本和酶标志物先在试管中等量混和均匀后再加入酶标板小孔杯中可降低抗-HBc检测的假阳性率。

2.4 温育温育是ELISA至关重要的一步，不同的温育环境对检测结果有影响，操作中应严格按照说明书控制温育时间及温度，并注意封闭避免边缘效应。为确保各板温度都能迅速达到平衡，不可将反应板叠加放置，设定的温度及时间严格按照说明书进行，一般加入待测标本后使其与固相抗原(抗体)置于37℃环境下温育。因为很多恒温箱的构造，温度及检测的温度并非酶标板温育温度，所以使用恒温箱温育时建议将温度计置于酶标板旁，保证酶标板旁温度为37℃。干育和水温的影响差异较为明显，建议使用水温，注意将固相板放入水中，防止受热不均匀。

温育时间是影响检测结果的一大因素，实际操作过程中工作人员常常试图缩短温育时间提高工作效率，曹青梅等[36]通过实验证明，对于低浓度的标本，待测标本与固相抗体反应时间过短，极易引起漏检，反应时间最少30min以上。罗保红等[37]报道，酶标反应预孵时间在温室中不超过15min，不但能保障ELISA检测抗-HIV、抗-HCV的实验结果，还能提高试剂检测的灵敏度。其传统温育采用水温箱易受污染，现多采用电热、电子恒温培养箱温育，研究[38]表明温育方式对ELISA检测物影响。陈怀霞[39]报道，ELISA检测中，温度对抗原、抗体及酶反应的影响很大，温度增高，分子运动加速，并可能出现非特异性反应，出现假阴性或者假阳性结果，检测控制恒温37℃可保证检测的准确性。

2.5 洗板洗板目的在于将特异性结合于固相上的抗原(抗体)与温育过程中吸附的非特异性成份分离，使免疫复合物与待测抗体(抗原)呈一定比例，洗板是否合格直接影响检测结果的准确性。洗板应严格按照说明控制洗板时间及洗板次数，ELISA检测一般用洗涤液洗板3次，洗涤液应严格按照操作说明进行稀释，洗液应注满每个微孔并注意洗液不外溢，垂直甩板避免交叉污染，防止出现假阴性及假阳性结果。使用洗板机洗板可一定程度上避免环境污染、提高工作效率，洗涤开始时注意观察每根吸液针是否一直插入孔底并吸干孔内全部液体，严格按照要求设置一定的洗板时间及洗板次数。洗板过程中注意冲力大小，避免冲力过大导致酶结合物丢失，吸光度值偏低。洗液应根据不同厂家的酶标板调整注水量，注意不要溢出孔外；稀释洗液所用的蒸馏水或去离子水酸碱度适中，使配出的洗液pH在7.2~7.6范围内，用非金属容器保存，保持液体新鲜无污染、沉淀。洗板结束后将板拍干，应垂直扣在备好的干净的吸水纸或毛巾上，且注意每次更新干净的吸水纸或毛巾。

洗板时还应注意以下问题：(1)需每天校正注液量及残液量，洗涤后残液量不得大于2μl；(2)及时更换破损吸液针，避免破坏底板包被；(3)针对不同厂家酶标板注意调整吸液头下降高度，避免冲洗针头卡住酶标板；(4)注意调整洗液量，洗液量过多将溢出，过少将达不到洗涤效果；(5)关机前使用蒸馏水冲洗管道，避免洗液的结晶物堵塞管道；(6)不同种试剂盒的洗液严禁混合使用。

临床操作中，工作人员由于担心洗板次数过少达不到去除非特异性物质的理想效果而增加洗板次数，最近研究发现[5]，随着洗板次数的增加样本检测的OD值降低，造成假阴性结果及灰区标本的漏检。

2.6 显色及结果判断试剂显色时A、B液按顺序加入且间隔不超过10min，如先将两液混合再加样则需保证等体积混合。显色剂不宜过多，注意避光反应。显色是最后一步温育反应，酶将无色底物催化反应呈有色，反应的温度和时间均为影响结果的重要因素，目前市场上大多数进口的ELISA检测显色温度处于18~30℃。一定时间内，阴性孔可保持无色，但阳性孔会随时间的延长而显色加强。研究[40]表明，显色温度对实验结果有明显影响，显色温度不同，试剂最低检测能力差距非常大，温度低于21℃时试剂盒对于质控物的检出能力下降，温度过低导致结合反应速率变慢[41]，显色不充分，造成低值阳性结果的漏检，所以操作中应严格控制温度。显色时间不宜过短，因为一些低滴度可能不能及时出现反应，造成假阴性结果。结果判断应按照说明书在规定时间内完成，研究报道[42]终止反应后的时间对OD值结果有明显影响，10~15min阳性结果OD值逐渐下降，阴性结果的OD值有所上升，所以必须严格按照操作说明进行，薛春杨等认为结果判断需在加入终止液后10min内完成，避免出现孔内结晶影响酶标仪的测试，避免强光下进行。

在加液和混合过程中产生气泡、微孔条底部不透明、带水滴、有划痕及不规则的表面都可能引起吸光值的升高，易造成假阳性结果，若显色但酶标仪读值为阴性的灰色值样区的样本不管其是否来源于高危人群均需复检并参考参比试剂。

2.7 其它因素实验室的环境亦是影响试验结果的一大因素，合理控制实验室的通风、采光及防尘，实验室的温度及湿度可使用空调加以控制，湿度控制在35%~65%间，并避免噪音及电磁波干扰。

检测结果对受检者的家庭、生活及工作非常重要，可能带来严重的精神痛苦及巨大的心理压力，因此检验工作者应不断提高自身素质，加强使命感与责任心，尽职尽责认真对待每一份待检标本，严格按照实验室的标准化操作，试剂的选择和准备、样品的采集和储存、操作等方面，严格按照说明书要求，规范化操作，同时做好实验室内质控[44，45]、室间质评，排除影响因素，严格控制试验环境，牢牢把关试剂选择、试验温度、仪器设备等每一环节，最大限度地降低检测的系统误差，加强自身理论知识的学习，在工作中总结经验、扬长避短，减少人为因素对试验结果造成影响，提高检测的准确性，减少假阴性、假阳性结果的出现。

3 小结

ELISA检测广泛应用于乙肝、丙肝、梅毒、艾滋以及结核等传染类疾病的诊断，对于含有疑似干扰物的待检样本做相应分析，在保证结果可靠的前提下尽量避免二次抽血。为保证检验工作者的自身安全，操作时必须带好口罩、手套，穿好工作衣，严格进行规范操作，防止交叉感染。有条件的情况下可使用酶联免疫反应加速仪缩短反应时间，提高工作效率[46]。

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