预处理对核桃肽抗氧化活性的影响

吕 莹，杨柏崇，王 莹，陈 怡，陈文茜，韩 涛

（1.北京农学院食品科学与工程学院，农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室，北京 102206；2.谱尼测试科技股份有限公司食品实验室，北京100080）

核桃富含不饱和脂肪酸、核桃蛋白和内皮多酚等成分，对健康调节起着重要作用，目前核桃的深加工产品主要有核桃油、核桃乳和核桃粉等。核桃粕是核桃榨油后的副产物，约含有30%～50%的蛋白质[1－2]。核桃蛋白主要由四类蛋白质构成：白蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，分别占核桃蛋白总量的6.81%、17.57%、5.33%和70.11%[3]。大量研究表明，核桃蛋白的体外酶解物：核桃肽具有抗氧化活性[1－2，4]。现有的研究发现，对原料进行预处理，如加热或采用物理场，可以破坏蛋白质、多糖等生物大分子物质的空间结构，使其易于被酶解、提高目标产物的得率，或增强酶解物的功能性。加热、微波和超声波处理是目前常用的蛋白质变性的方法。对经过超声波预处理的燕麦蛋白进行酶解，发现其产物燕麦肽的ACE抑制活性显著增加[5]；而采用微波辅助水解法制备丝素肽能大大降低能耗，节省成本[6]。目前有关核桃肽的抗氧化活性研究多集中在酶解条件的优化上[1，7－8]，不同的预处理方法对核桃肽抗氧化活性的影响未见报道。因此，本研究考察了直接酶解、碱提、加热、微波、超声波预处理高温和低温脱脂核桃粕对核桃肽抗氧化活性和得率的影响，以及由两种核桃粕提取核桃蛋白后进行酶解得到核桃肽抗氧化活性的差异，为核桃蛋白的应用提供基础，也为核桃深加工技术提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

低温脱脂核桃粕（液压冷榨法制油）河北省石家庄京丸有限公司；高温脱脂核桃粕（螺杆挤压法高温榨油） 北京绿湖工贸公司惠赠；中性蛋白酶和碱性蛋白酶 诺维信公司惠赠；风味蛋白酶、酸性蛋白酶和复合蛋白酶 日本天田野酶制剂有限公司；其他试剂 均为分析纯。

Wave－1000型微波紫外超声波合成萃取反应仪上海新仪微波化学科学科技有限公司；PP－25型pH计 德国赛多利斯；FD－1C－50型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；LXJ－ⅡB型离心机 上海安亭科学仪器厂；UV－1800型紫外－可见分光光度计 日本岛津。

1.2 低温和高温脱脂核桃粕中提取核桃蛋白

脱脂核桃粕粉碎，按料液比1∶15（w∶v）加水，用5.0mol/L NaOH溶液调节pH8.0～9.0，50℃浸提1h。离心（4000r/min，20min），去除沉淀。上清液加5.0mol/L HCl调pH至5.0，静置30min，离心（4000r/min，20min），沉淀用蒸馏水洗两遍。加入5.0mol/L NaOH溶液调节pH7.0，得上清液，冷冻干燥即为核桃蛋白[4]。

1.3 核桃粕的预处理

1.3.1 超声波预处理核桃粕 4g高温或低温脱脂核桃粕，加入100mL蒸馏水，搅拌器搅拌溶解，超声波处理15min，温度为室温，功率300W。

1.3.2 微波预处理核桃粕 4g高温或低温脱脂核桃粕，加入100mL蒸馏水，搅拌器搅拌溶解，微波处理3min，温度为75℃，功率300W。

1.3.3 水浴加热预处理核桃粕 4g高温或低温脱脂核桃粕，加入100mL蒸馏水，搅拌器搅拌溶解，水浴（90～95℃）条件下加热10min。

1.3.4 碱提预处理核桃粕 4g高温或低温脱脂核桃粕，加入100mL蒸馏水，搅拌器搅拌溶解，采用0.5mol/L NaOH将溶液pH调节至7.5，溶解1h。

1.3.5 50℃碱提预处理核桃粕 4g高温或低温脱脂核桃粕，加入100mL蒸馏水，搅拌器搅拌溶解，采用0.5mol/L NaOH将溶液pH调节至7.5，50℃溶解1h。

1.4 核桃肽的制备

1.4.1 由核桃蛋白制备核桃肽 核桃蛋白（2%）用5.0mol/L HCl和5.0mol/L NaOH调到酶解最适pH→加入各种蛋白酶（酸性蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、复合蛋白酶和风味蛋白酶）→在酶最适作用温度下水解4h→得到酶解液→离心（4000r/min，20min）→上清液→真空冷冻干燥得到核桃肽（每种酶的酶解条件见表1）。

1.4.2 由核桃粕直接酶解制备核桃肽 4g高温或低温脱脂核桃粕→加入100mL蒸馏水搅拌器搅拌溶解→用5.0mol/L HCl或5.0mol/L NaOH调到中性蛋白酶酶解最适pH→在酶最适作用温度下水解4h→得到酶解液→离心（4000r/min，20min）→上清液→真空冷冻干燥得到核桃肽。

1.4.3 由经过预处理的核桃粕酶解制备核桃肽 经过预处理的核桃粕（4%，w/v）→用5.0mol/L HCl或5.0mol/L NaOH调到中性蛋白酶酶解最适pH→在酶最适作用温度下水解4h→得到酶解液→离心（4000r/min，20min）→上清液→真空冷冻干燥得到核桃肽。

核桃肽得率以核桃肽冻干粉的重量与酶解前核桃蛋白或核桃粕重量之比来表示。

1.5 核桃肽抗氧化活性的测定

核桃肽的抗氧化活性以核桃肽的总还原能力表示。核桃肽配制成1mg/mL溶液，取样品液2mL，加入2mol/L pH6.6的磷酸盐缓冲溶液，再加入2mL、1%的铁氰化钾溶液充分混合。混合物于50℃加热20min后加入2mL TCA（10%），充分混合后离心（4000r/min，10min）。取上清液2mL加入2mL蒸馏水和0.4mL、0.1%的FeCl3，三者充分混合。反应10min后，于700nm下测定混合液吸光值。以蒸馏水作对照，核桃肽的还原能力以（样品的吸光值—对照的吸光值）表示，吸光值越高，表示其还原能力越强[9]。

1.6 统计分析

实验结果以方差分析ANOVA来检测平均值之间的差异，以p＜0.05为差异显著。统计分析使用OriginPro 7.5软件。

2 结果与讨论

2.1 五种酶酶解核桃蛋白

实验采用总还原能力方法评价酶解得到核桃肽的抗氧化活性，结果如表2所示。其中，中性蛋白酶酶解核桃蛋白得到核桃肽的总还原能力最强，显著高于其他四种酶（p＜0.05）；复合蛋白酶酶解得到核桃肽的抗氧化活性也较高（1.02±0.01）；而风味和酸性蛋白酶酶解得到核桃肽的抗氧化活性最低。本研究中由工业用酸性蛋白酶M得到核桃肽的抗氧化活性较低，这一研究结果与用胃蛋白酶酶解核桃蛋白得到核桃肽的研究结果一致[1]，不同的是本研究中是采用总还原力评价肽段的抗氧化活性，而后者采用的是DPPH法。另外，从各蛋白酶酶解核桃肽的得率可以看出中性蛋白酶和复合蛋白酶酶解得到核桃肽的得率也较高，分别为89.00%和87.00%（见表2）。因此，根据不同酶酶解核桃蛋白得到核桃肽的抗氧化活性和得率的结果，选择中性蛋白酶作为酶制剂进行下一步实验，考察不同的预处理方式对以低温或高温脱脂核桃粕为原料制备核桃肽的得率和抗氧化活性影响。

2.2 不同预处理方式对低温脱脂核桃粕酶解所得核桃肽的抗氧化活性和得率的影响

低温脱脂核桃粕为核桃榨油过程中采用冷压榨工艺得到的副产物，其中的蛋白质仍为未变性状态。采用水浴加热、超声波、微波和碱提等预处理，考察核桃蛋白变性后酶解得到核桃肽的抗氧化活性的差异，结果如图1所示。从低温核桃粕中提取核桃蛋白并酶解得到核桃肽的抗氧化活性显著高于其他以核桃粕为原料制备的核桃肽（p＜0.05）；而经过碱提、微波预处理的核桃粕酶解得到核桃肽的抗氧化活性要显著高于直接酶解、加热和超声波预处理的核桃肽（p＜0.05）。可见，与直接酶解核桃粕相比，本研究选用的碱提和微波预处理可以提高核桃肽的抗氧化活性。

表3为经过不同预处理得到核桃肽的得率，对经过预处理的核桃粕进行酶解，核桃肽得率均高于直接酶解核桃粕的得率。预处理破坏蛋白质的空间结构，使蛋白质结构松散，暴露出更多的酶切位点，进而提高酶解效率，得率明显增加。

核桃蛋白中谷蛋白为主要成分[3]。谷蛋白的特性为易溶于稀酸或稀碱，因此，在所有的预处理中，经过碱提的预处理操作能提高核桃粕中核桃蛋白的溶解性，使其更易于与溶液的酶分子相互作用，酶解得到的核桃肽无论是抗氧化活性还是得率均较高。从微波和超声波预处理核桃粕的效果来看，微波加热对核桃粕的影响较为明显，抗氧化活性和得率与直接酶解核桃粕相比，明显增加（见图1和表3）。目前有关微波与蛋白质的酶解研究多集中在酶解过程中采用微波辅助加热以缩短酶解时间和能耗上。本研究表明，采用微波对低温核桃粕进行预处理（300W、75℃、3min）可以显著提高核桃肽的得率和抗氧化活性。已报道的有关采用超声波对蛋白质进行预处理的研究中，对燕麦麸皮进行超声波处理（190W、55℃、28min）显著提高了燕麦肽的ACE抑制活性[10]；而对燕麦蛋白进行超声波预处理（50W、20min）时燕麦肽的ACE抑制活性提高，但水解度变化并不明显[5]。本研究采用的超声波处理条件是300W、15min、室温，在该条件下对低温核桃粕进行预处理，核桃肽的得率和抗氧化活性与直接酶解相比虽有所增加，但效果不如其他的预处理方式。

另外，由低温核桃粕提取核桃蛋白的提取率为15%～16%，核桃蛋白进行酶解，核桃肽的得率为89%。但由核桃粕提取核桃蛋白须经碱溶、酸沉、离心等工艺。而由核桃粕经过各种预处理酶解得到核桃肽的得率为25.75%～47.3%。可见，工业生产中，与提取核桃蛋白需要的设备和条件相比，直接以经过适当预处理的核桃粕为原料制备核桃肽更符合低成本的需求。

2.3 不同预处理方式对高温脱脂核桃粕酶解核桃肽的抗氧化活性和得率的影响

不同预处理方式对高温脱脂核桃粕酶解核桃肽的抗氧化活性影响如图2所示，核桃粕直接酶解得到核桃肽的抗氧化活性虽然高于碱提和核桃蛋白酶解得到的核桃肽，但相互之间的差异并无显著性。而超声波预处理后酶解得到核桃肽的抗氧化活性略低于50℃碱提和微波处理得到的核桃肽，但同样的并不存在显著性差异。表3所示的高温核桃粕经过不同的预处理，核桃肽的得率也相差不多。另外，由高温核桃粕提取核桃蛋白后再进行酶解得到的核桃肽的得率为82.9%，而图2的结果显示，直接酶解核桃粕和提取核桃蛋白后酶解得到核桃肽的抗氧化活性相差不多。因此，虽然由核桃蛋白酶解核桃肽的得率提高，但提取核桃蛋白的工艺过于繁琐，且高温核桃粕提取核桃蛋白的得率低（0.63%）。为降低成本，可以直接以高温核桃粕为原料生产核桃肽。

高温核桃粕为核桃通过螺旋压榨的工艺制得，压榨过程中温度过高，核桃蛋白变性，使预处理对高温核桃粕酶解得到核桃肽的抗氧化活性和得率的影响不明显。另外，高温核桃粕的颜色为深褐色，酶解出来的核桃肽与低温核桃粕酶解得到的核桃肽相比颜色较深。

3 结论

本文通过研究发现，对低温脱脂核桃粕进行预处理可以提高其酶解得到核桃肽的抗氧化活性和得率，其中碱提和微波预处理的效果明显。但由于提取核桃蛋白的工艺过于繁琐，工厂生产中为降低成本，可以对核桃粕进行适当预处理后直接酶解。而高温脱脂核桃粕进行碱提等预处理与直接酶解得到核桃肽的抗氧化活性无明显差异。本文通过研究不同预处理方式对低温和高温脱脂核桃粕酶解得到核桃肽的抗氧化活性和得率的影响，为核桃的深加工提供基础。

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