二次回归正交旋转组合优化罗非鱼下脚料酶解液螯合锌的工艺条件

2013-04-06李同刚洪鹏志

食品工业科技 2013年2期

李同刚，洪鹏志，杨萍，赵阳

（广东海洋大学食品科技学院，广东湛江524088）

罗非鱼是当前淡水养殖业的重要养殖品种之一。我国是世界上最大的罗非鱼养殖国及出口国，2009年产量已达120万t，约占当年世界总产量的一半。罗非鱼冻鱼片加工过程中会产生总质量40%以上的下脚料[1-3]。罗非鱼下脚料蛋白酶解液含有丰富的氨基酸、小肽、微量元素等多种小分子营养成分，具有生物利用率高等优点。锌是人体必需微量元素，参与体内200多种酶的组成，是细胞内最丰富的微量元素。根据报道，锌是中国人缺乏的营养素之一，尤其是儿童、青少年缺锌比较严重，严重的已经影响智力和身高的正常发育。目前关于酶解物螯合金属元素的研究很多，如赵洪雷等[4]制备了低质鱼小肽螯合锌；杨珊珊等[5]研究了罗非鱼皮多肽制备锌螯合盐；钟明杰[6]用带鱼下脚料蛋白水解原料得到了钙、铁螯合物；汪学荣[7]使用猪血多肽制备铁螯合盐等。本实验利用复合酶酶解罗非鱼下脚料，对酶解液与锌的螯合工艺进行优化，探讨螯合的最佳工艺条件，旨在为罗非鱼下脚料的综合加工利用提供新途径，并希望为人体补锌提供安全、绿色原料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

罗非鱼下脚料由广东恒兴水产公司提供，罗非鱼下脚料（包括头、鱼骨排、内脏）去内脏，洗净，于绞肉机中绞碎后-18℃冻藏备用；中性蛋白酶（2.0×105U/g）、风味蛋白酶（1.5×104U/g）均购于南宁庞博生物工程有限公司；EDTA、硫酸锌均为分析纯，购于广州化学试剂厂；二甲基橙分析纯，广东光华化学厂有限公司。

PHS-3C酸度计上海精密科学仪器有限公司；Mini pellicon超滤机美国Thermo公司；DK-98-1电热恒温水浴锅天津市泰斯特仪器有限公司；CR22GⅡ高速冷冻离心机日本日立公司；EMS-4B磁力搅拌器天津市欧诺仪器仪表有限公司；N-1100旋转蒸发仪上海爱朗仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶解液的制备取罗非鱼下脚料一定量置于烧杯中，按固液比1∶4加水，于55℃的恒温水浴锅中预热，按总加酶量1500U/g、中性蛋白酶与风味蛋白酶复合比1∶2加酶，pH不调，酶解30min。然后沸水灭酶15min，4500r/min离心15min得到上清液。将上清液通过0.45μm膜微滤，再过10ku超滤膜得到小于10ku的酶解液。

1.2.2 α-氨基态氮的测定甲醛滴定法[8]。

1.2.3 螯合工艺

1.2.3.1 配位比对螯合率的影响酶解液与硫酸锌在配位比（α-氨基态氮与锌离子的摩尔比[9]）设为1.0∶1、1.5∶1、2.0∶1、2.5∶1、3.0∶1。

1.2.3.2 温度对螯合率的影响螯合温度设为40、50、60、70、80℃。

1.2.3.3 时间对螯合率的影响时间设为10、15、20、25、30min。

1.2.3.4 pH对螯合率的影响螯合pH设为5、6、7、8、9。

在单因素实验基础上，进行二次回归正交旋转组合设计。螯合工艺流程：酶解液→测α-氨基态氮→按比例加Zn2+→搅拌→振荡合成→离心分离→真空浓缩→乙醇洗涤→测螯合率。

1.2.4 螯合率的测定 EDTA络合滴定法[10]。

式中：C-EDTA标准溶液的浓度，mol/L；V1-滴定螯合态微量元素所消耗的EDTA溶液体积，mL；V0-滴定微量元素的总量所消耗的EDTA溶液体积，mL。

1.2.5 二次回归正交旋转组合设计依据单因素实验的结果，确定因素编码水平范围，采用二次回归正交旋转组合设计，以螯合率为指标，取配位比、温度、时间、pH作为考察因素，共进行31次实验，因素编码见表1。

1.2.6 实验结果处理本实验均做了三次平行，结果为三次实验的平均值。

2 结果与分析

2.1 酶解液与硫酸锌螯合的单因素实验

2.1.1 配位比对螯合率的影响配位比是影响螯合率的一个重要因素，因为配位比过小不能形成稳定的环状结构[5]，导致螯合率较低；反之过大，螯合物虽稳定但是螯合率也在下降，造成原料的浪费，经济上也不合理。由图1可知，在温度60℃，时间15min，pH6.5时，配位比对螯合率的影响呈波动变化，配位比在2.5∶1时螯合率达到最大值。

2.1.2 温度对螯合率的影响由图2可知，在配位比2.5∶1，时间15min，pH6.5条件下，随着温度的升高螯合率也升高，当温度在60～70℃时螯合率最高，再升高温度螯合率下降。这是由于螯合反应为吸热反应[11]，温度高有利于螯合反应，但温度过高酶解液里的肽及其螯合物的结构易被破坏；温度过低，反应速率慢，螯合率不高。

2.1.3 时间对螯合率的影响由图3可知，在配位比2.5∶1，温度60℃，pH6.5条件下，时间在15min时螯合效果最佳，10min时螯合反应不完全，所以螯合率不高；15min之后随着超滤酶解液中肽或氨基酸浓度的降低，螯合率也在下降。

2.1.4 pH对螯合率的影响由图4可知，在配位比2.5∶1，温度60℃，时间15min条件下，pH对螯合率影响很大，随着pH升高螯合率先升后降，pH=7时效果最佳，当pH在5、6时螯合率缓慢上升，当pH＞7以后螯合率下降很快。原因可能是当溶液中H+大量存在时，H+会与锌离子争夺供电子基团，不利于螯合物的生成；另外，在碱性条件下，羟基争夺锌离子而优先生成氢氧化锌沉淀而影响螯合物的形成[12]。

2.2 二次回归正交旋转组合优化酶解液与硫酸锌的最佳螯合条件

2.2.1 经验数学模型在单因素实验的基础上，根据表1因素水平编码表进行二次回归正交旋转组合实验，实验设计及结果见表2。

将实验结果经Design Expert软件处理，得到回归方程：Y=87.59286+1.09375X1+0.72125X2+0.47375X3-0.87625X4+0.30437X1X3+1.06938X2X3+1.30563X2X4-1.39228-2.17853-1.81603-1.717282。

2.2.2 二次回归模型的显著性检验二次正交旋转组合设计实验结果方差分析如表3所示。

为检验回归方程的有效性，按F1=失拟均方/误差均方，F2=回归均方/剩余均方的程序进行检验。由表3可知，在0.01水平上失拟项F1不显著、F2极显著，这表明方程与实验数据的配合是可行的，可以用来建立模型。

根据表3，剔除α=0.10显著水平不显著项后，简化后的回归方程为：Y=87.59286+1.09375X1+0.72125X2+0.47375X3-0.87625X4+1.06938X2X3+1.30563X2X4-1.39228-2.17853-1.81603-1.71728。

该模型的R2=0.95588，R2adj=0.91727，说明回归方程对实际实验拟合情况较好。

2.2.3 模型验证为验证模型的适用性，选取4组结果进行验证。结果见表4。

由表4可知，4组的螯合率测定结果与根据模型计算得到的结果误差均小于5%，说明该模型能较好地反映螯合过程螯合率的变化情况。

2.2.4 各因素的重要性分析在表3里，因为X1、X2、X3、X4的均方分别为28.71094、12.48484、5.38654、18.42754，所以影响螯合率的四因素主次顺序为：配位比＞pH＞温度＞时间。

2.2.5 最佳螯合条件的确定采用Design Expert软件分析实验数据，得到螯合的最佳条件为：配位比0.39水平（2.70∶1），温度0.25水平（71.25℃），时间0.22水平（15.44min），pH为-0.29水平（6.86），理想螯合率可达88.08%。考虑到实验室允许的条件以及实际应用过程中的必要性和可操作性，对优化的工艺参数进行了合理选择，即配位比2.70∶1、温度71.3℃、时间15min、pH6.86，验证实验结果表明，此时螯合率可达87.56%，与理论值相差1%之内。在相关研究中，低质鱼蛋白多肽在理想条件下与铁的螯合率为94.15%[5]；带鱼下脚料蛋白水解液在最佳条件下与钙螯合，螯合率达79.75%[6]，大部分植物蛋白螯合率不高。相比之下，本实验得到的螯合条件较合理。