脱脂米糠中清蛋白和球蛋白的提取工艺及氨基酸组成分析

王艳玲，张 敏

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.北京工商大学食品学院，北京 100037）

稳定化米糠提取米糠油之后，副产品脱脂米糠中还含有20%左右的蛋白质，可用来进一步开发米糠蛋白产品。与传统生产植物蛋白的大豆粕、花生粕相比，米糠中蛋白质的含量偏低，但作为世界第一大作物的加工副产品，仅在我国，米糠的年产量就达到了1000万t，因此米糠中蛋白质的数量是不容忽视的[1]。米糠蛋白含有的必需氨基酸完全，氨基酸组成更接近FAO/WHO的推荐模式；赖氨酸含量比大米胚乳、小麦面粉以及其他谷物中的都要高，生物效价（PER为2.0～2.5）与牛奶中的酪蛋白相近（PER为2.5），消化率达90%以上，是一种营养价值很高的植物蛋白。米糠蛋白还有一个最大的优点：低过敏性，它是已知谷物中过敏性最低的，可用于婴幼儿食品中[2]。米糠蛋白质组成，根据Osborne提出的以溶解特性来划分，可分为清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白，这四种蛋白质的比例大致为37∶36∶22∶5，由此可见，米糠中清蛋白和球蛋白含量较高，其中清蛋白和球蛋白是由单链组成的低分子量蛋白质，它为代谢活性蛋白质，含有很多生理活性蛋白质，在稻谷发芽早期可迅速启动进行生理作用[3]。尽管人们早就认识到米糠的营养和药用价值，但到目前为止，人们尚未很有效利用米糠蛋白。由于米糠中蛋白质是一个复合的体系，含有清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶谷蛋白，是一个组成复杂的混合物；米糠蛋白的溶解性较差，极易发生沉淀，这主要是由于蛋白分子间存在很强的二硫键相互作用；米糠中的植酸和纤维素含量较高，这两种物质与蛋白质紧密结合，使得蛋白质不易分散出来[4]。国内外已对小麦蛋白组分、大豆蛋白和玉米醇溶蛋白等进行了大量的研究和应用，张春红和周小婷[5]采用Osborne法对麦胚蛋白进行分级，得到麦胚清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4种组分；管骁和姚惠源[6]也按照Osborne蛋白分级提取方法对燕麦麸蛋白进行了精细的分类，分别得到了燕麦麸清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。而目前对米糠蛋白组分研究的较少，本实验参照Osborne方法对米糠中蛋白组分进行分级提取，依次利用蒸馏水和NaCl溶液来提取米糠中清蛋白和球蛋白，确定两种米糠蛋白产品的最佳提取工艺并对两种产品的氨基酸组成进行测定，以期对今后米糠产品的深度开发和利用提供科学的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

脱脂米糠 黑龙江省北大荒米业有限公司提供（原料组成为：水分7.1%、蛋白质19.1%、脂肪2.8%、纤维素23.1%、淀粉16.0%）；米糠蛋白 以脱脂米糠为原料采用碱溶酸沉法实验室自制的蛋白产品；牛血清白蛋白 美国Sigma公司；其他试剂 均为国产分析纯。

722型可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；pH-3c型pH计 上海伟业仪器厂；SC-3614型低速离心机 安徽中科中佳科学仪器有限公司；日立L8800型氨基酸自动分析仪 日本日立公司。

1.2 实验方法

1.2.1 米糠清蛋白和球蛋白的提取工艺[7]图1为米糠清蛋白和球蛋白的提取工艺流程。取20g脱脂米糠，加一定料液比的蒸馏水浸提，在一定温度下搅拌一段时间后，4000r/min离心20min得上清液和残渣，其中上清液经酸碱调至清蛋白等电点4.1，4000r/min离心20min，将沉淀透析后冷冻干燥得米糠清蛋白粉；残渣继续用一定浓度的NaCl按一定的料液比在一定温度下提取一段时间，再经4000r/min离心20min得上清液，将上清液调至球蛋白等电点4.3，4000r/min离心20min，将沉淀透析后冷冻干燥得米糠球蛋白粉。

1.2.2 蛋白得率的测定方法[8]提取液中蛋白质含量测定用福林酚法[9]测得。

蛋白得率（%）=提取液中蛋白质量/米糠质量×100

1.2.3 脱脂米糠清蛋白的提取工艺研究[10-11]本实验分别以料液比、提取时间、提取温度为影响因子，对米糠清蛋白提取工艺进行单因素实验。

分别按照1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14的料液比加入蒸馏水，于50℃恒温水浴锅中提取2.5h，离心取上清液测定体积和蛋白含量，计算获得蛋白得率。

以料液比1∶10加入蒸馏水，在50℃恒温水浴锅中分别提取1.5、2、2.5、3、3.5、4h，离心取上清液测得蛋白得率。

以料液比1∶10加入蒸馏水，分别在25、30、35、40、45、50、55℃下提取2.5h，离心取上清液测得蛋白得率。

通过单因素实验结果，选取工艺参数范围，以米糠蛋白得率为指标，按L9（34）表设计正交实验，选取的因素水平见表1。

1.2.4 米糠球蛋白的提取工艺研究 以蛋白得率为研究指标，以料液比、提取时间、提取温度、NaCl浓度为影响因素，对米糠清蛋白提取工艺进行单因素实验。

称取5份残渣，用2%的NaCl溶液溶解，料液比分别在1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14的条件下，于45℃提取2h。离心后测定上清液的体积和蛋白含量，计算获得的蛋白得率。

用2%的NaCl料液比为1∶10溶液溶解，分别在45℃提取1.5、2、2.5、3、3.5、4h时，离心测定上清液的蛋白得率。

用2%的NaCl料液比为1∶10溶液溶解，分别在温度为35、40、45、50、55℃时，提取2h后，离心测定上清液的蛋白得率。

NaCl溶液的浓度分别在1%、2%、3%、4%、5%、6%时，料液比为1∶10，45℃提取2h。离心测定上清液的蛋白得率。

通过单因素实验结果，选取工艺参数范围，以米糠蛋白得率为指标，按L9（34）表设计正交实验，选取的因素水平如表2所示。

1.2.5 氨基酸组成分析[12]准确称取样品20mg加入8mL的6mol/L HCl冲入氮气封口，在110℃烘箱内水解22h，冷却摇匀过滤，双蒸水定容至50mL，润洗3次以上，取1mL冻干至干燥，冻干后加入1mL 0.02mol/L HCl摇匀，14000r/min离心15min，吸取上清液0.8mL过0.45μm滤膜，上日立L8800型氨基酸自动分析仪。

2 结果与分析

2.1 清蛋白提取工艺的单因素实验

2.1.1 料液比对米糠清蛋白得率的影响 提取米糠清蛋白的料液比与清蛋白得率的关系曲线如图2所示。

由图2测定结果可以看出，当料液比在1∶12之前，米糠清蛋白得率随料液比的增加而增大，料液比继续增加，提取率的提高不明显。由于米糠中含有一定量的膳食纤维和淀粉，具有较强的吸水膨胀能力，料液比过低时物料变得黏稠，流动性差，不易搅拌，蛋白不易溶出；清蛋白是水溶性蛋白，提高料液比可以提高蛋白质的提取率[13]。但过高的料液比会降低提取液的蛋白浓度，增加生产成本。

2.1.2 提取时间对米糠清蛋白得率的影响 提取米糠清蛋白的时间与清蛋白得率的关系曲线如图3所示。

由图3可以看出，米糠清蛋白的得率在2h前随着提取时间的增加蛋白得率明显增加，3h后提取率增加变缓甚至出现轻微降低的趋势。分析原因可能在于，随着提取时间的延长，清蛋白大部分溶解于水中，提取率增加；3h后继续延长提取时间，蛋白得率出现下降，这与陈季旺[14]的提取率随时间延长而增大的结论不同，应该与提取温度有关。文献采用在室温条件下提取，蛋白溶出较慢，需要长时间。温度的升高可加速蛋白溶出，在本文50℃的提取条件下，随时间延长可能使蛋白发生了少部分水解或聚合反应，从而使提取液中蛋白质的含量略微降低[15]。

2.1.3 提取温度对米糠清蛋白得率的影响 提取米糠清蛋白的温度与清蛋白得率的关系曲线如图4所示。

由图4可以看出，随着温度的升高，米糠清蛋白得率不断增加，45℃时蛋白得率达到最大，当温度超过45℃时蛋白得率开始下降。可能的原因是蛋白发生水解引起。有报道[16]称，米糠开始糊化温度为60～75℃，淀粉的糊化使原来的悬浮液变成了粘性很强的淀粉糊，阻碍了蛋白质的溶出，从而降低了蛋白质的得率。本研究获得的提取清蛋白和球蛋白的提取温度与其他文献[14]报道不同，可能与原料来源、颗粒状态以及提取蛋白种类等不同有关。

2.2 清蛋白提取的正交实验

以蛋白得率作为评价指标，清蛋白的正交实验结果如表3和表4所示。

对表3的正交实验结果进行极差分析可知，影响脱脂米糠中清蛋白得率因素的主次顺序为A＞B＞C，即料液比对清蛋白得率的影响最大，提取时间次之，提取温度的影响最小。最佳工艺参数组合为A3B3C2，即正交实验表中的第9组实验，在料液比为1∶14，提取时间为3h，温度为45℃条件下，可获得最高提取率（14.64%）的米糠清蛋白产品。

表4的方差分析结果表明，料液比对米糠清蛋白提取得率影响显著（F比＞F临界值），而其他因素对米糠清蛋白提取得率影响不显著，即料液比为清蛋白提取的关键因素。

2.3 提取球蛋白的单因素实验

2.3.1 料液比对米糠球蛋白得率的影响 提取米糠球蛋白的料液比对球蛋白得率的关系曲线如图5所示。由图5可以看出，提取米糠球蛋白的料液比在小于1∶10时，随料液比增大米糠球蛋白得率增大；料液比大于1∶10后，继续增加料液比，米糠球蛋白的蛋白得率出现降低。这与蛋白质的分解及提取液使球蛋白浓度降低有关。与清蛋白相比，球蛋白的最佳料液比相对减少了很多，分析原因可能是由于经过清蛋白提取后，原料已吸收一部分水分，再提取球蛋白时，所需料液比明显降低。

2.3.2 提取时间对米糠球蛋白得率的影响 提取米糠球蛋白的反应时间与球蛋白得率的关系曲线如图6所示。

由图6可知，球蛋白得率在2h之前随时间延长而增加，在2h处达到最大值；在2h之后随时间延长蛋白得率出现降低趋势，分析原因可能是随提取时间延长蛋白发生了部分水解和聚合反应，使蛋白质的提取率降低。

2.3.3 提取温度对米糠球蛋白得率的影响 提取米糠球蛋白的反应温度与球蛋白得率的关系曲线如图7所示。

由图7可知，提取温度在50℃之前，球蛋白得率随提取温度的升高逐渐增大，在50℃时球蛋白得率达到最大值，在50℃之后随温度的继续升高，球蛋白得率缓慢下降。与清蛋白相比，球蛋白的提取温度较高，这与球蛋白的水溶性差有关。

2.3.4 NaCl浓度对米糠球蛋白得率的影响 提取米糠球蛋白的反应NaCl浓度与球蛋白得率的关系曲线如图8所示。

由图8可以看出，在NaCl浓度为3%时蛋白得率达到最大值，之后呈下降趋势。可见高浓度的盐并不能增大得率，这与朱科学[17]提取小麦胚芽球蛋白时，使用的NaCl浓度相一致。实验中发现，盐浓度越高，混合液粘度越大，实验操作越不易进行。

2.4 球蛋白正交实验

以球蛋白得率作为评价指标，球蛋白的正交实验结果如表5和表6所示。

对表5的正交实验结果进行极差分析可知，影响脱脂米糠中球蛋白得率因素的主次顺序为D＞A＞C＞B，即NaCl浓度对球蛋白得率的影响最大，料液比次之，提取时间的影响最小。最佳工艺参数组合为A1B1C2D2，即料液比为1∶10、提取时间为2h、温度为50℃，NaCl浓度为3%。

表6方差分析结果表明，NaCl浓度、料液比对米糠球蛋白提取得率影响显著（F比＞F临界值），而其他因素对米糠清蛋白提取得率影响不显著，即NaCl浓度、料液比为球蛋白提取的关键因素。

在较优参数组合条件下进行三次验证实验，脱脂米糠提取球蛋白的蛋白得率为4.25%、4.31%、4、29%，平均蛋白得率为4.28%，高于正交表中所有组合的实验结果，证明了正交实验的可靠性。

2.5 氨基酸组成分析

表7是测定的米糠蛋白、米糠清蛋白和米糠球蛋白的氨基酸组成数据结果。

米糠蛋白是一个包含清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白的蛋白混合物体系，清蛋白和球蛋白则是具有不同天然构象的混合物。从表7可以看出，米糠蛋白和清蛋白、球蛋白氨基酸含量有所不同。米糠蛋白的各种氨基酸含量大多都低于清蛋白和球蛋白，只有丙氨酸含量明显高于二者，甘氨酸含量大于米糠清蛋白而小于米糠球蛋白，赖氨酸和苏氨酸含量低于米糠清蛋白高于米糠球蛋白；这三种米糠的蛋白产品中，丙氨酸和甘氨酸的含量均高于其他氨基酸。在米糠蛋白的氨基酸组成中含有半胱氨酸，而在其他二种蛋白中没有检测出半胱氨酸。半胱氨酸是一种具有生理功能的氨基酸，是组成蛋白质的20多种氨基酸中惟一具有还原性基团巯基（-SH）的氨基酸。从亲水性氨基酸和疏水性氨基酸的含量来看，这三种蛋白产品的亲水性氨基酸含量相差较大，疏水性氨基酸的含量相差不多，且亲水性氨基酸的含量远高于疏水性氨基酸的含量。有研究表明[18]，可以根据蛋白产品的氨基酸含量来判断其功能性质。有关米糠蛋白产品功能性质有待进一步深入的研究。

从实验结果可以看出，米糠蛋白和清蛋白、球蛋白中均含有人体必需的七种氨基酸（因酸水解破坏了色氨酸导致测不出），其组成均接近FAO/WHO模式，并且苯丙氨酸+酪氨酸含量远高于FAO/WHO模式推荐值。组氨酸虽不是人体必需氨基酸，但对于婴儿而言却是必需氨基酸，米糠清蛋白中组氨酸的含量相对较高。

3 结论

本实验对米糠中清蛋白和球蛋白提取工艺进行研究，结果表明，料液比对脱脂米糠中清蛋白得率影响显著，而提取时间、提取温度影响不显著。清蛋白提取最佳工艺为：料液比1∶14、提取时间3h、温度45℃，清蛋白得率为14.64%。NaCl浓度和料液比对米糠球蛋白的提取得率影响显著，球蛋白提取的最佳工艺为料液比1∶10、提取时间2h、温度50℃、NaCl浓度3%，球蛋白得率为4.28%。

米糠蛋白和清蛋白、球蛋白进行的氨基酸分析表明，米糠蛋白产品中氨基酸组成平衡，富含功能性氨基酸，氨基酸的含量接近FAO/WHO推荐模式，是较好的植物蛋白质来源。

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