中心组合设计优化酶法提取胖大海多糖工艺

孙 鹏，裴国亮，孙先锋

（1.西安工程大学环境与化学工程学院，陕西西安 710048；2.西北农林科技大学旱区作物逆境生物学国家重点实验室，陕西杨凌712100）

胖大海为梧桐科苹婆属植物（Sterculia lychnophora Hance）的干燥成熟种子，是一种传统的清咽润喉的中药材，也是卫生部公布第三批药食两宜的资源，其具有清热润肺、利咽解毒、润肠通便的功效。临床用于肺热声哑、干咳无痰、咽喉干痛、热结便闭、头痛目赤的治疗[1-2]。目前国内外对胖大海的研究较少，仅限于做茶饮、甜点和含片等清咽润喉的保健品，开发利用程度较低，缺乏对其活性成分的系统研究与利用。多糖是胖大海的主要生物活性成分[3]，目前对其多糖的提取主要有水煎法、超声波法和微波法[4-5]，但酶法提取尚未见报道，本文以胖大海为原料，运用中心组合实验设计及响应面分析法对胖大海多糖的纤维素酶提取工艺进行优化，确定纤维素酶提取胖大海多糖的最佳参数，为其进一步的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

胖大海 购自陕西西安老百姓大药房；纤维素酶 购自肇东国科北方酶制剂有限公司（10000U/g）。

紫外可见分光光度计 上海光谱厂；LG10-2.4型离心机 北京医用离心机厂；SHZ-III循环水式真空泵 上海亚荣生化仪器厂；FW-200高速万能粉碎机 北京中兴伟业仪器有限公司；电子天平 北京赛多利斯天平有限公司；RE-52A型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 胖大海多糖的提取 将胖大海置于干燥箱中

60℃干燥，自然冷却后粉碎过60目筛，精密称取5g粉末，加入一定体积蒸馏水，将pH调至4.8，加入一定的纤维素酶搅匀，并置于恒温水浴摇床中，转速设定为180r/min，酶解提取完成后将提取容器置于95℃水浴中灭酶6min，再用旋转蒸发仪于70℃下浓缩，加入浓缩液1/4体积的Sevag试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1）[6]，振荡处理15min，离心获得（4000r/min，3min）上清液，再加入3倍体积的无水乙醇，充分搅拌静置过夜，离心（5000r/min，10min）得沉淀，沉淀用75%乙醇水溶液分散，再离心，弃去上清液，以此法清洗可除去沉淀中夹带的少量单糖和低聚糖等水溶性杂质。沉淀洗2次后再次离心后的沉淀用蒸馏水溶解并定容到25mL，最后用苯酚-硫酸法测定多糖含量。

1.2.2 胖大海多糖测定及得率计算 胖大海多糖的测定采用苯酚-硫酸法[7]，以葡萄糖（mg/mL）作为标准品测定提取液中复水多糖液中胖大海多糖的含量，葡萄糖标准曲线为y=0.2756x－0.0076（R2=0.9983）。胖大海多糖的得率计算如下：Y（%）=[（C×V）/M]×100，式中：Y为胖大海多糖得率（%）；C为由回归方程求得的胖大海多糖浓度（mg/mL）；V为复水多糖液体积（mL）；M为胖大海质量（g）。

1.2.3 单因素及响应面实验设计 通过单因素实验，分别考察料液比、纤维素酶添加量、酶解温度和时间对胖大海多糖得率的影响。根据单因素实验结果，采用中心组合实验设计和响应面法优化确定料液比、纤维素酶酶添加量和酶解时间对响应值的影响。设定中心组合实验设计各因素水平编码值见表1。

2 结果与分析

2.1 料液比对胖大海多糖得率的影响

称取胖大海粉末5.0g，称取5组，每组2份，将料液比分别调至1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，将pH调至4.8，加入纤维素酶1.5%，45℃浸提2h，按1.2.1提取胖大海多糖，结果如图1所示。

由图1可知，随着料液比的逐渐增加，胖大海多糖得率逐渐增加，料液比由1∶10增大到1∶30时，多糖得率显著增加，继续增加料液比后，多糖得率增加缓慢，这主要是由于随着料液比的增加，胖大海内部和溶液主体的多糖浓度差增大，导致推动力增大，从而有利于多糖的溶出。当料液比为1∶30时，大部分多糖已溶出，继续增加料液比，导致单位体积提取液中多糖浓度降低，不利于后续浓缩工作，且对多糖的得率无显著性增加。

2.2 纤维素酶添加量对胖大海多糖得率的影响

准确称取胖大海粉末5.0g，称取5组，每组2份，料液比1∶25，将pH调至4.8，加入纤维素酶，使其浓度分别为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%（W∶V），45℃浸提2h，按1.2.1提取胖大海多糖，结果如图2所示。

由图2可知，随着纤维素酶浓度的增加，胖大海多糖得率增大。当加酶量大于2.0%时，继续增加酶浓度，多糖得率没有明显提高，说明在该底物浓度下，单位底物上的酶浓度已经趋于饱和，胖大海多糖已溶出，继续增加纤维素酶用量，对胖大海多糖得率没有显著影响。

2.3 酶解温度对胖大海多糖得率的影响

称取胖大海粉末5.0g，称取5组，每组2份，料液比1∶25，将pH调至4.8，加入纤维素酶1.5%，分别在40、45、50、55、60℃下浸提2h，按1.2.1提取胖大海多糖，结果如图3所示。

由图3可知，当酶解温度低于50℃时，胖大海多糖得率随着温度的升高而显著增加；当温度高于50℃时，多糖得率随温度升高而降低，当温度高于55℃时，多糖得率迅速降低。这是因为酶是一类具有最适反应温度范围的物质，过低温度会抑制酶的催化活力，过高温度会导致酶失活。根据单因素实验确定最佳酶解温度为50℃。

2.4 酶解时间对胖大海多糖得率的影响

称取胖大海粉末5.0g，称取5组，每组2份，料液比1∶25，将pH调至4.8，加入纤维素酶1.5%，45℃下分别提取1.0、1.5、2.0、2.5、3h，按1.2.1提取胖大海多糖，结果如图4所示。

由图4可知，胖大海多糖得率随着酶解时间的增加不断提高，但当提取时间大于2h后，多糖得率增加趋于平缓，说明增加酶解时间可以使纤维素酶对细胞壁中的多糖充分溶出，但酶解时间过长，酶的催化活性降低，进而对多糖的得率影响不大。

2.5 胖大海多糖提取工艺优化

为优化单因素实验得到的工艺条件，采用中心组合实验设计对酶解工艺的主要影响因素进行优化实验。中心组合实验设计及结果见表2。

应用Design Expert 8.06软件响应面分析程序对实验结果进行回归拟合，得到二次多元回归模型为：

对该模型的方差分析见表3，由表3可知，模型p＜0.0001，失拟项p=0.1869＞0.05，相关系数R2=0.9960，表明模型的相关性很好，R2Adj相关系数=0.9424，表明响应面的94.24%的变化可以由此模型解释，模型与实际情况拟合的很好。变异系数CV越低，实验的可信度和精确度越高，变异系数CV=4.41，实验数据可靠，分析结果可信，因此可以用此回归方程对实验结果进行分析和预测。

由表3还可知，纤维素酶酶解提取胖大海多糖的工艺参数中，影响多糖得率的因素为：纤维素酶添加量＞酶解时间＞料液比，其中纤维素酶添加量（X1）和酶解时间（X3）达到极显著水平，料液比（X2）达到显著水平，料液比与酶解时间之间存在交互作用，且达到极显著水平。

图5～图7为各因素对响应值（胖大海多糖得率）影响的响应面图，其直观地反映出各因素交互作用对响应值的影响，等高线的圆形表示二因素交互作用不显著，椭圆表示二因素交互作用显著[8]。由图7可知，料液比和酶解时间的交互作用显著，而图5、图6中两因素之间的交互作用不显著。采用Design Expert 8.06软件分析，得到响应面胖大海多糖最大值点对应的各因素的水平分别为纤维素酶添加量1.92%，料液比1∶30.5，酶解时间126min，此时胖大海多糖最大理论得率为8.16%。采用上述最优条件进行胖大海多糖提取实验，实际获得5组平行实验平均多糖提取率为7.92%±0.09%，与理论预测值误差为1.84%～4.04%，说明该模型预测性很好，运用中心组合设计及响应面分析法优化得到的模型参数准确可靠，具有实践指导意义。

3 结论

影响胖大海多糖得率的工艺参数按主次顺序排列为纤维素酶添加量＞酶解时间＞料液比。响应面法优化的最佳提取工艺条件为纤维素酶添加量1.92%，料液比1∶30.5，pH4.8，50℃下酶解时间126min，在此条件下，胖大海多糖得率为7.92%±0.09%。

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