响应面法优化马血中S O D超声波提取工艺研究

热孜耶·喀日，米丽班·霍家艾合买提，热合满·艾拉，许铭强

（新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐830052）

超氧化物歧化酶（SOD）是广泛存在于生物体内的一类金属酶[1]，它能催化超氧阴离子自由基发生歧化反应，从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基，是生物体重要的细胞防御系统之一[2]，有抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗辐射和消炎作用[3]。SOD主要存在于血细胞中，因此要提取SOD，必须使细胞膜破碎，通常使用的方法有：溶胀法[4]、机械破碎法、酶溶法、有机溶剂法。目前，SOD用于延缓人体衰老，防止色素沉着，并治疗慢性多发性关节炎等症，也被广泛地应用于生产日用化工品，如SOD化妆护肤品，对抗衰老、去除脸面雀斑等有明显的效果。随着日用化工产品的发展及SOD在临床上的应用，SOD的需求量越来越大[5]。我国是一个传统养马大国，有15个地方品种和11个培育品种，约占世界马品种的十分之一。目前，存栏马匹达到790万匹，居世界之首[6]。马血是一种宝贵的蛋白质资源，具有很高的药用价值，但对其提取方面的系统研究还很少。目前，一般从动物血中提取SOD的工艺多为正交设计，但此方法精确度不高，且不能考虑因素之间的交互作用。响应面分析法是一种优化工艺条件的高效方法，可确定各因素及其交互作用在工艺过程中对指标（响应值）的影响，精确地反映因素与响应值之间的关系[7]。本研究从食品安全的角度考虑，以响应面方法优化超声波提取马血中SOD，考察超声条件对提取SOD比活力的影响，以期对动物血资源的综合开发利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

马血 华菱屠宰场；柠檬酸三钠、氯化钠、邻苯三酚、盐酸、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）、考马斯亮蓝G-250、牛血清蛋白、乙醇 以上皆是分析纯。

HH-54数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂；KQ-250DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；TD5A-WS台式低速离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；TU-1810紫外可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；PL203电子天平 梅特勒托利仪器有限公司；DZKW-D-2型电热恒温水浴锅 北京市光明医疗仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 红细胞的制备 取新鲜马血与0.38%柠檬酸三钠体积比为1∶7的溶液，搅拌均匀，以3000r/min的速度离心15min，除去血浆，收集红细胞，用2倍体积的0.9%NaCl溶液洗涤3次，在-15℃条件下保存备用。

1.2.2 响应面法优化提取条件 为了优化超声波提取工艺条件，选取超声时间、超声功率、超声温度做单因素实验；在单因素实验的基础上，根据Box-Behnken中心组合实验设计原理，采用三因素三水平的响应面分析法进行实验设计，确定马血中SOD超声波提取的最佳工艺条件，实验因素与水平见表1。

1.2.3 蛋白质含量测定[8]考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量。

1.2.4 SOD活性测定[9]邻苯三酚自氧化法测定SOD活性。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 超声时间对SOD提取的影响 准确取15mL自然解冻的红细胞置于试管中，加入以3∶1的蒸馏水，搅拌15min后，在超声功率200W，温度40℃条件下分别处理5、10、15、20、25min，测定蛋白质的浓度和酶的活性。重复三次实验，确定合适的超声时间，结果见图1。

由图1可知，随着超声时间的延长，SOD比活力也增加，当超声时间为15min时，提取液中SOD比活力为76.1U/mg。继续延长超声时间，SOD比活力随之降低，这可能是由于超声波的高强度机械作用和空化作用使SOD变性失活，因此，确定最佳超声时间为15min。

2.1.2 超声功率对SOD提取的影响 准确取15mL自然解冻的红细胞置于试管中，加入以3∶1的蒸馏水，搅拌15min后，在超声功率分别为：160、180、200、220、240W温度40℃条件下处理15min，测蛋白质的浓度和酶的活性，结果见图2。

通常超声功率越高，越容易获得较大的声强，但超声功率对SOD比活力的影响不能一概而论，而要考虑超声波与介质相互作用的程度和提取物的性质。由图2可知，随着超声功率的增加，SOD比活力不断增加，当超声功率在220W时，提取液中SOD比活力为81.1U/mg；而继续增加超声功率，SOD比活力随之降低，因此，选择超声功率为220W。

2.1.3 超声温度对SOD提取的影响 准确取15mL自然解冻的红细胞置于试管中，加入以3∶1的蒸馏水，搅拌15min后，在超声功率220W，超声温度分别为：15、30、45、60、75℃下分别处理15min，测蛋白质的浓度和酶的活性，结果见图3。

从图3可知，超声温度在30℃时，SOD比活力为78.2U/mg，高于30℃后SOD比活力缓慢下降，因为温度高，细胞膜在未破碎、SOD未溶出时，细胞已经变性，导致了溶液中SOD含量下降，比活力降低，另外，高温也会导致SOD变性，从而使SOD的比活力降低。

2.2 以SOD比活力为响应值的响应面实验

利用统计分析Design-Expert软件进行Box-Behnken实验，结果见表2。

2.2.1 数学模型的建立[10]根据表2所得的实验数据，采用响应面统计方法对实验数据拟合，建立SOD比活力与超声时间、超声功率、超声温度三因子的二次多项数学回归方程：

回归模型方差分析见表3，模型的p=0.0003＜0.01，说明对马血中SOD建立的回归模型是极显著的，失拟项p=0.0971＞0.05不显著，相关系数R2=0.9639，表示模型的拟合度良好，实验误差较小。三因素对SOD比活力的影响顺序为：超声温度＞超声时间＞超声功率。因此可以选用此模型对SOD的超声波提取工艺进行分析和预测，能确定所得到的二次回归方程模型是合适的。

2.2.2 响应面分析与优化 图4是以SOD比活力为响应值的响应曲面图，通过对相应的等高线及响应曲面分析，由Design-Expert软件给出响应图的预测值，SOD比活力78.3739U/mg，其对应的工艺参数是：超声时间15.02min、超声功率220.17W、超声温度30.56℃。

对回归模型进行数学分析，交互项AC对SOD比活力的影响显著。随着超声时间和超声温度的上升，SOD比活力呈现先上升后下降的趋势。

在模型给出的条件下，按实际条件确定：超声时间15min、超声功率220W、超声温度31℃，在此条件下做3组平行实验，以检验模型的准确性。所得的SOD比活力分别为77.5、76.9、78.1U/mg，平均值为77.5U/mg。验证值77.5U/mg和预测值78.3739U/mg非常接近，说明回归方程可以较真实的反映各筛选因素的影响，建立的模型与实际情况比较吻合，再次证明该回归模型的可行性。

3 结论

采用超声波萃取法从马血中提取SOD，利用实验设计软件Design-Expert，通过响应面分析法建立马血SOD超声波提取工艺的数学回归模型，并对各因子对SOD比活力的影响进行了分析，得出影响马血SOD提取的各因素顺序依次为：超声温度＞超声时间＞超声功率；马血SOD超声波提取工艺的最佳参数为：超声时间15min、超声功率220W、超声温度31℃，在此条件下，SOD比活力为77.5U/mg。

[1]张良，薛刚，张彩莹，等.牛血铜锌超氧化物歧化酶分离提取新工艺[J].食品科学，2004，25（8）：121-123.

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[3]于颖，王小丽，徐桂花.响应面分析法优化羊血中SOD的热变性提纯工艺条件[J].肉类研究，2009（11）：25-30.

[4]邱玉华，杨艳芳，何颖，等.等电点沉淀一超滤提取猪血SOD[J].科技资讯，2008，14：23.

[5]金应世，金晓玲.从动物血液提取SOD的工艺流程及技术[J].中国资源综合利用，2000（11）：13-14.

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