苏木对甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌抗菌活性研究及其活性成分分离＊

蒲 荣，郭永灿，区敬华，刘红志，谭光羡（.东莞市寮步医院检验科，广东东莞 5400；.重庆医科大学临床检验诊断学省部共建教育部重点实验室，重庆 40006；.中山大学药学院药理教研室，广东广州 50080）

甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌（MRSA）是院内感染主要病原体，具有多药耐药性，分离率高，治疗困难，致死率高，部分地区感染率高达90%，且耐药基因呈多样性［1－3］。西药抗菌药物易诱导细菌耐药且毒性较大，中药不易诱导耐药菌的产生，且不良反应较弱。因此，从中药中寻找抗MRSA中草药成为研究焦点。苏木是中国传统中药，为豆科云实属植物的干燥心材，有抗菌消炎、行血祛瘀、免疫抑制等功效［4］。因此，本文研究了苏木抗MRSA活性及其活性成分，以期为研发新型抗MRSA药物奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 本院检验科微生物室保存的MRSA菌株。甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）标准菌株ATCC29213由广东省临床检验中心提供；已鉴别证实的苏木购自东莞市药材公司，产地为中国云南；NIH小鼠由中山大学实验动物中心提供；三氯甲烷、甲醇购自天津市百世化工有限公司；M－H琼脂培养基、M－H牛肉汤购自广东环凯微生物试剂公司；柱层析硅胶和薄层层析硅胶均为青岛海洋化工厂产品；葡聚糖凝胶Sephadex LH－20为GE Healthcare Bio－Sciences AB公司产品，溶剂均为分析纯。

1.2 仪器 桂林广陆有限公司精度0.01mm游标卡尺，Waters Alliance 2690高效液相色谱仪，996二极管阵列检测器，Waters 2010色谱工作站。

1.3 方法 （1）按抽溶剂不同分成3组，即甲醇组、氯仿组、水组。称取苏木心木8 000g，碾成粉末，过20目筛，备用。各取300g苏木心粉溶于1 000mL甲醇和1 000mL氯仿，室温浸泡72h，过滤，浓缩，减压干燥，称重。取300g苏木心粉加入3 000mL水中，煮沸60min，过滤，减压干燥，称重。将3组提取物用二甲基亚砜（DMSO）配制浓度8mg／mL的药液备用。因本实验各步骤均以前一步骤为基础，故具体操作方法在结果中描述。

1.4 统计学处理 采用SPSS13.0软件进行数据分析；数据多组间比较采用方差分析；显著性检验水准为α＝0.05。

2 结 果

2.1 苏木不同提取液MIC值 制备浓度为107CFU／mL菌液；将各组苏木8mg／mL的提取物药液10mL倍比稀释，溶于90mL M－H肉汤中，倾注平板，形成800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、0μg／mL共10个浓度梯度；接种细菌，35℃培养18～24h后判读MIC值，比较不同提取液对MRSA及MSSA的MIC值。结果显示苏木甲醇提液抗MRSA能力最强，MIC为200μg／mL，对 MSSA的 MIC为400μg／mL（P＜0.05），苏木水提取液次之。见表1。

表1 苏木不同组别提取液抗MRSA的MIC值（μg／mL）

2.2 苏木分离组分抑菌圈与MIC值 参照赵焕新等［5－6］的方法分离苏木组分，取苏木甲醇提取液，采用乙酸乙酯萃取、硅胶柱色谱、Sephadex LH－20柱色谱、ODS柱色谱等方法分离组分，将各组分用DMSO配制浓度200μg／mL的药液，点种于M－H平板，筛选抑菌圈并倍比稀释测定MIC值。共分离获得16种组分；抑菌圈直径为14.85、12.95、12.70mm和小于12.50mm；组分最小MIC值为12.50μg／mL，与其他组分比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 苏木分离组分抑菌圈直径与MIC值

2.3 最佳抗MRSA组分鉴定 收集MIC为12.5μg／mL组分，参照赵焕新等［5－6］的方法鉴定，同时取该组分和巴西苏木素对照品2μL，点样硅胶GF254薄层板上，三氯甲烷、丙酮、甲酸（8∶4∶1）展开，取出，晾干，紫外光灯254nm下检视。结果显示该组分呈浅黄色结晶，10%H2SO4显棕红色，色谱位置与巴西苏木素一致，显相同的颜色斑点，电喷雾质谱相对分子质量为286，结合氢谱和碳谱信号及Namikoshi等［7］的文献数据资料，确定该组分为巴西苏木素。

2.4 安全性实验 清洁级NIH小鼠40只，体质量18～22g，雌雄各半，观察3d，未见活动、进食、粪便异常；随机分成4组，每组10只，每笼5只，室温23～28℃，湿度40%～70%条件下饲养；连续7d皮下注射12.5、25、50μg／mL巴西苏木素和生理盐水各0.2mL／d，连续14d观察急性毒性反应和死亡情况等指标，结果显示40只动物活动、正常、粪便均正常，无明显不良反应，无小鼠死亡。

3 讨 论

苏木不同提取物对MRSA抗菌活性不同［8］。本研究证明苏木的不同提取物抗菌能力差异较大，醇提取物的抗菌活性最强，对MRSA、MSSA的MIC分别为200、400μg／mL。和生琦等［9］应用生物传感器跟踪技术筛选证实黄药子、五倍子、半枝莲、山豆根、黄连、草果、核桃根等7种对MRSA有不同程度抑制作用的中草药。

巴西苏木素抗MRSA高效且无不良反应。本研究证明，巴西苏木素对107CFU／mL菌液的抑菌圈直径为14.85mm，MIC为12.50μ／mL，且对NIH小鼠无不良反应。巴西苏木素为苏木中最主要的化学成分，结构独特，在天然产物中少见，药理活性主要有免疫、镇静消炎及抗补体作用。Kim等［10］发现苏木中的巴西苏木素对MRSA、耐万古霉素肠球菌（VRE）、具有多药耐药性的洋葱伯克霍尔德菌及其他菌种具有很强的抑制作用，MIC为4～32μg／mL。

中药抗MRSA具有较好的优势。MRSA具有多药耐药性，耐药基因也呈多样性，如β－内酰胺酶类药物耐药基因mecA、氨基糖苷类药物耐药基因aac／aph、大环内酯类－林可霉素－链阳霉素B类耐药基因ermA／ermB／ermC、四环素类药物耐药基因tetM、氟喹诺酮类耐药基因norA及万古霉素耐药基因vanA等。中草药不易诱导产生耐药菌株，且不良反应小。本研究证实苏木醇提取物具有较好的抗MRSA活性，其组分巴西苏木素抗MRSA活性高且无不良反应，为探索新型抗MRSA药物奠定了一定基础。

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