苹果属无融合生殖相关SERK4基因表达载体的构建

张丽杰，董文轩

（沈阳农业大学 园艺学院，辽宁 沈阳 110866）

植物的生殖发育阶段是其整个生命过程中非常重要的阶段。由于植物的无融合生殖习性具有重要的生物学意义，并在缩短育种周期、固定杂种优势等方面具有重大潜力，因此，植物无融合生殖研究已是生物学研究的热点之一。SERK(Somatic Embryogenesis Receptor-like Kinase)基因，全称为“体细胞胚胎发生相关类受体蛋白激酶基因”[1]，是体胚发生过程中最重要的基因，通常认为，SERK基因与无融合生殖习性密切相关。SERK基因最初为Schmidt等人[2]在胡萝卜Daucus carota的下胚轴中发现。随后，有关研究者又在拟南芥Arabidopsis thaliana[3]、玉米Zea may[4]、苜蓿Medicago truncatula[5]等植物中克隆和鉴定了SERK基因。目前，科学家们已经从向日葵Helian thusannuus[6]、 鸭 茅Dactylis glomerata[7]、 可 可Theobroma cacao[8]、 蜜 柑Citrus unshiu[9]、 草 地 早熟禾Poa pratensis[10]等植物中分离到不同的SERK基因。有关研究结果证明，SERK基因广泛存在于双子叶植物、单子叶植物及裸子植物中，组成了一个新的基因家族[11]。

无融合生殖现象在苹果属多倍体植物中普遍存在。无融合生殖后代是母本的复制品，不含有来自父本的遗传物质，保持了母本的全部特征。平 邑 甜 茶Malus hupehensis（Pamp.）Rehd.varpingyiensisJiang是苹果属Malus湖北海棠Malus hupehensisRehd.的一个变种，是典型的无融合生殖型三倍体植物。平邑甜茶具有非常高的无融合生殖能力，其无融合生殖率在95%以上；但其杂交后代四倍性皱叶矮生株系的无融合生殖能力却显著降低。

为了探索SERK4基因在苹果属平邑甜茶及其杂交后代33#无融合生殖习性上的功能与作用，阐明该基因在植物胚胎发育过程中的表达特性，以平邑甜茶及其杂种后代33#株系的cDNA为模板，扩增出MhSERK4和MhdSERK4基因cDNA全长，再将其克隆到植物表达载体pBI121中，获得了MhSERK4和MhdSERK4基因的植物表达载体pBI121-MhSERK4和pBI121-MhdSERK4，旨在将其转化到番茄中，为进一步研究SERK基因影响无融合生殖的机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

供试的植物材料为苹果属三倍体无融合生殖型平邑甜茶Malus hupehensis(Pamp.) Rehd.var.pingyiensisJiang及其与扎矮山定子M.baccata杂交的后代四倍体皱叶矮生株系33#的花期子房。

1.2 菌株与质粒

克隆载体PGM-T购自天根生物公司，植物表达载体pBI121和农杆菌由沈阳农业大学张志宏教授馈赠。

1.3 试 剂

限制性内切酶XbaI和SmaI、T4DNA连接酶、AMV反转录酶等试剂购自TAKARA生物公司，DNA Marker购于北京天根生化科技有限公司，质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购于上海生物工程公司。

1.4 方 法

1.4.1 引物设计与合成

根据已获得的平邑甜茶及其与扎矮山定子杂交获得的杂种后代33#株系无融合生殖基因MhSERK4和MhdSERK4基因的CDS编码区设计引物，在开放读码框两端分别设计上游引物和下游引物，上游引物引入XbaI酶切位点，下游引物引入SmaI酶切位点。引物由赛百盛生物公司合成。

MhSERK4和MhdSERK4引物设计如下：

上游引物SF为 5’GGTCTAGAATGACGTCTT CCACCTCTGTTTC 3’；

下游引物SR为 5’ACCCCGGGTCATCTAGG ACCGGACAACTCAT 3’。

1.4.2 平邑甜茶及其杂交后代皱叶矮生33#株系RNA的提取及RT-PCR扩增

采用常规CTAB法提取平邑甜茶及其杂交后代皱叶矮生33#株系的子房RNA，在20 μL的反应体系中加入RNA样品，在AMV反转录酶作用下合成cDNA第一链。其反应程序为：65 ℃水浴5 min，立即置于冰上2～3 min，在PCR仪中37 ℃ 2.5 h，70 ℃ 15 min，使酶失活，反转录合成cDNA。

1.4.3 目的基因的扩增

目的基因的扩增采用20 μL反应体系。上下游 引 物 各 1 μL，dNTP 2.0 μL，ExTaq 0.25 μL，10×Buffer 2.5 μL，cDNA 1.0 μL，ddH2O 补 足 至20 μL。PCR 反应程序为：94 ℃预变性 5 min（94 ℃变性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸2 min）；30个循环；72 ℃后延伸10 min。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳纯化，去除引物及引物二聚体，试剂盒回收目标条带。

1.4.4 pBI121-MhSERK4和pBI121-MhdSERK4的构建

将平邑甜茶及其杂种后代33#株系进行PCR扩增获得的cDNA全长序列测序正确的PGM-MhSERK4和PGM-MhdSERK4克隆载体与CaMV35S组成型启动子驱动的pBI121植物表达载体分别用限制性内切酶XbaI和SmaI进行双酶切，XbaI的识别位点为TCT AGA，SmaI的识别位点为CCC GGG。酶切体系为20 μL：XbaI和SmaI各 1 μL，BSA 2 μL，10×Buffer 2 μL，目的基因质粒14 μL。用琼脂糖凝胶电泳检测目的片段；使用AxyPrep胶回收试剂盒回收目的片段，并利用NEB公司生产的T4DNA连接酶将MhSERK4和MhdSERK4基因定向插入pBI121表达载体中报告基因的位置，然后连接转化，挑取单克隆进行PCR鉴定，将以PCR法鉴定出的阳性克隆送北京华大生物有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 RNA质量检测

取3 μg所提平邑甜茶和杂交后代33#株系的RNA，在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，结果如图1所示。图1显示，RNA条带清晰且完整。使用美国Beckman 公司生产的核酸蛋白分析仪检测RNA 的含量和质量，结果表明：OD260/OD280的比值分别为1.916 1和1.926 3，说明RNA的纯度较高，无蛋白污染，可以用于后续的试验。

图1 RNA质量检测结果Fig.1 Result of RNA quality detection

2.2 目的基因的PCR扩增

以平邑甜茶和杂种后代33#子房cDNA为模板，采用设计的引物序列进行PCR扩增，结果如图2所示。由图2可知，扩增出约1 836 bp的片段，其大小与预期的结果一致，可以用于下一步的试验。

图2 PCR扩增结果Fig.2 Result of PCR ampli fi cation

2.3 pBI121-MhSERK4载体的鉴定

用回收试剂盒回收PCR产物，并且用XbaI和SmaI酶切PCR产物，用限制性内切酶XbaI和SmaI酶切载体pBI121，鉴定结果如图3所示。然后连接转化，挑取单克隆作PCR鉴定，鉴定结果见图4。最后选取该阳性菌送往华大生物有限公司进行测序分析，分析结果表明，其与PCR扩增的cDNA序列的同源性达99.69%，说明是我们需要的目的基因。这一结果与预期结果一致。

图3 双酶切鉴定结果Fig.3 Identi fi cation result of double enzyme digestion

图4 PCR鉴定结果Fig.4 PCR identi fi cation result

3 讨 论

成功构建载体是进行转基因研究的前提。植物表达载体pBI121是从根癌农杆菌双元质粒衍生而来的，属组成型的表达载体，其大小为14 753 bp，带有多个克隆位点，上游带有CaMV35S启动子，下游带有GUS报告基因[12]；因此，pBI121是常用的植物表达载体[13]。在载体构建过程中会受到多种因素的影响，不同的基因及不同的载体需要不同的反应条件和体系。此外，基因序列的大小和载体的不同也是影响载体构建的重要因素。为了分析从苹果属分离出来的MhSERK4基因的生物学功能，通过DNA测序和序列酶切位点分析，以XbaI和SmaI限制性内切酶双酶切带有目的基因全长片段的克隆载体和pBI121植物表达载体，经1%琼脂糖凝胶电泳分析回收后，成功构建了MhSERK4和MhdSERK4植物遗传转化载体，目前正在进行转基因的研究。

参考文献：

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[11] Santos MDO, Romano E, Yotoko KSC,et al.Characterisation of the cacao somatic embryogenesis receptor-like kinase (SERK)gene expressed during somatic embryogenesis[J].Plant Sci,2005, 168(3): 723－729.

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