杜仲α-亚麻酸生物合成相关基因的差异表达

李铁柱，杜红岩，刘攀峰

（1.中国林业科学研究院 经济林研究开发中心，河南 郑州 450003；2.国家林业局 杜仲工程技术研究中心，河南 郑州 450003）

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.是我国特有名贵药用树种[1-4]，杜仲种仁中富含油脂脂肪酸，主要成分组成为豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和α-亚麻酸等6种脂肪酸组分[5]。α-亚麻酸（α-linolenic acid，ALA）在杜仲翅果种仁中含量高达66.4%[6]，是目前发现的植物中α-亚麻酸含量最高的木本植物之一，具有极大的开发潜力[7-11]。研究发现0.25～1.00 g/kg剂量的杜仲籽油可显著降低大鼠血清甘油三酯及胆固醇含量[12-14]。

亚麻酸可分为α-亚麻酸（α-linolenic acid，ALA）和γ-亚麻酸（γ-linolenic acid，GLA）2种，它们均是18个碳原子3个双键直链脂肪酸，相对分子质量为278[15-16]。其中，α-亚麻酸结构为顺9，顺12，顺15十八碳三烯酸，简记为9,12,15-18:3；γ-亚麻酸结构为顺6，顺9，顺12十八碳三烯酸，简记为6,9,15-18:3[17]。二者差异仅在于其中1个双键位置不同。在天然油脂中，根据多不饱和脂肪酸甲基端距离最近双键碳原子数的不同，将不饱和脂肪酸分为3个系列：以油酸为主的n-9系列；以亚油酸、亚油酸、花生四烯酸为主的n-6系列；以α-亚麻酸、EPA、DHA为主的n-3系列。这3个系列的脂肪酸在体内不能相互转换。n-3系列亚麻酸可在体内代谢为EPA和DHA，所以α-亚麻酸具有类似EPA、DHA的生理功能和化学特性[18]。α-亚麻酸ALA 的生物合成途径：硬脂酸在Δ9-脂肪酸脱氢酶的催化下生成油酸（oleic acid，OA），油酸在Δ12-脂肪酸脱氢酶的催化下生成亚油酸（linoleic acid，LA），随后，亚油酸进入多不饱和脂肪酸代谢的n-3 途径或直接进入n-6 途径（见图1）。在n-3途径中，LA在Δ15-脂肪酸脱氢酶的催化下转化成α-亚麻酸；而在n-6 途径中，LA经Δ6-脂肪酸脱氢酶的催化生成γ-亚麻酸。在上述2个反应中，Δ15-脂肪酸脱氢酶控制总反应的反应速度和方向，是ALA代谢途径的关键酶[19]。文中在杜仲果实和叶片转录组测序的基础上，比较分析α-亚麻酸合成途径中的系列基因在不同器官不同时期的表达差异，旨在为杜仲α-亚麻酸生物合成的分子调控机制研究提供理论依据。

图1 α-亚麻酸的生物合成的途径Fig.1 The pathway of α-linolenic acid biosynthesis

1 材料与方法

分别于2010年5月28日和10月28日，在国家林业局泡桐研究开发中心采集“华仲6号”杜仲优良品种叶片和果实，提取RNA，送至深圳华大基因公司进行转录组测序和基因功能注释[20-21]。

转录组测序得到的Unigene，利用NCBI网站上的BLAST工具，和其它物种已知的α-亚麻酸相关CDS序列进行在线比较，用相似性得分比较高的已知基因确定并命名杜仲转录组中的α-亚麻酸合成相关基因。基因确定后，分析该基因（或基因家族）在杜仲叶片和果实（幼嫩果实和成熟果实）中的表达量差异。

2 结果与分析

2.1 杜仲α-亚麻酸生物合成途径中注释的Unigene

2.1.1 杜仲幼果和成果中α-亚麻酸生物合成途径中注释的Unigene

杜仲幼果和成果转录组数据中α-亚麻酸合成途径，从硬脂酸起始，共涉及3个代谢位点（见图2）。位点3.1.2.2注释有Unigene1258、Unigene18404、Unigene9145等 3条 Unigene， 其中差异表达基因有4条；位点1.14.19.1注释有Unigene6936等4条Unigene，成熟果实特异表达有3条；位点1.14.19.-注释有Unigene1906等6条Unigene，幼果和成果中表达水平显著差异的有Unigene1条。

2.1.2 杜仲叶片和幼果中α-亚麻酸生物合成途径中注释的Unigene

杜仲叶片和幼果转录组数据中，α-亚麻酸合成途径共涉及3个代谢位点。位点3.1.2.2注释有Unigene19869、Unigene40659、Unigene40822等 3条Unigene，且均有显著的差异表达；位点1.14.19.1注释有Unigene6936；位点1.14.19.-注释有Unigene63、Unigene12834等2条Unigene，其中Unigene63在杜仲叶片和幼果中表达水平有显著差异。

2.2 杜仲α-亚麻酸生物合成关键酶基因的确定

2.2.1 杜仲幼果和成果中α-亚麻酸生物合成关键酶基因的确定

杜仲幼果和成果的转录组数据经过进一步BLAST分析后发现，Unigene1906、Unigene14989、Unigene18329等6条Unigene与茄子等植物的δ-15脂肪酸脱氢酶相似性达到55%～86%，其中Unigene14989为δ-15脂肪酸脱氢酶全长cDNA；Unigene6936、Unigene47927等 4条 Unigene与 油桐等植物的δ-9脂肪酸脱氢酶相似性达到71%～91%，其中Unigene47927为δ-9脂肪酸脱氢酶全长cDNA；Unigene1258、Unigene18404、Unigene9145与拟南芥等植物的酰基CoA硫酯酶相似性达到69%～81%，Unigene18404为酰基CoA硫酯酶全长cDNA（见表1）。

图2 KEGG数据库中的亚麻酸生物合成途径Fig.2 The KEGG pathway of α-linolenic acid biosynthesis

表1 杜仲幼果和成熟果α-亚麻酸合成途径中相关酶基因和对应Unigene相似度信息Table 1 The related enzyme genes and of corresponding Unigene similarity information in α-linolenic acid synthesis pathway in Eucommia ulmoides young fruit and mature fruit

2.2.2 杜仲幼果和叶片中α-亚麻酸生物合成相关酶基因的确定

杜仲幼果和叶片的转录组数据经过进一步BLAST分析后发现，Unigene63、Unigene12843与其它植物种的δ-15脂肪酸脱氢酶基因相似性分别达到79%和55%；Unigene10591与其它植物种的δ-9脂肪酸脱氢酶相似性达到73%；Unigene19869与其它植物种的酰基CoA硫酯酶相似性达到70%（见表2）。

2.3 杜仲EuFatA基因的表达差异

转录组分析结果表明，杜仲幼果和成熟果实中FatA获得3个拷贝，但序列比对后发现，3条FatA基因Unigene序列与葡萄的acyl-coenzyme A thioesterase 8 完全相同（见表3），故命名为EuFatA8。

基因表达量差异分析结果表明，3条FatA基因的Unigene表达量差异未达到显著水平，见表4和图3。

表2 杜仲幼果和叶片α-亚麻酸合成途径中相关酶基因和对应Unigene相似度信息Table 2 The related enzyme genes and of corresponding Unigene similarity information in α-linolenic acid synthesis pathway in Eucommia ulmoides young fruit and leaf

表4 EuFatA相关Unigene在杜仲幼果和成熟果中的表达量Table 4 Expression of related EuFatA Unigene in young fruit and mature fruit

图3 EuFatA相关Unigene在杜仲幼果和成熟果中的表达差异Fig.3 Expression difference of related EuFatA Unigene in young fruit and mature fruit

2.4 杜仲EuSAD基因的表达差异

硬脂酰-ACP去饱和酶（stearoyl-ACP desaturase，SAD），它是唯一一个可溶的去饱和酶，存在于质体中。在脂肪酸形成甘油脂之前，SAD催化引入第1个双键[22-23]。在杜仲的幼果和成熟果实中有被注释为SAD基因的Unigene共4有条，分别命名为EuSAD1～EuSAD4（见表5）。

表5 杜仲δ-9脂肪酸脱氢酶基因的多样性Table 5 Diversity of EuSAD genes

表达差异分析结果表明，EuSAD1～EuSAD4在成熟果实中均有表达，但只有EuSAD1的表达量较高，其它3个微量表达；而在幼果中只有EuSAD1表达，且表达量较高。EuSAD1在幼果中的表达量高于成熟果实，见表6和图4。推断杜仲幼果和成熟果实的SAD基因均以EuSAD1为主。

表6 SAD相关Unigene在杜仲幼果和成熟果中的表达量Table 6 Expression of related EuSAD Unigene in young fruit and mature fruit

2.5 杜仲EuFAD2基因的表达差异

在杜仲幼果和成熟果实中δ-12脂肪酸脱氢酶（FAD2）有5个拷贝（见表7），分别命名为EuFAD2-1～EuFAD2-5。

图4 SAD相关Unigene在杜仲幼果和成熟果中的表达差异Fig.4 Expression difference of related SAD Unigene in young fruit and mature fruit

表7 杜仲δ-12脂肪酸脱氢酶基因的多样性Table 7 Diversity of EuFAD2 genes

EuFAD2-1和EuFAD2-2这2条FAD2基因在杜仲幼果和成熟果实中的表达量差异达到显著水平，其余3条EuFAD2基因的表达量无显著差异；幼果中EuFAD2-4、EuFAD2-5的表达量超过成熟果实。

FAD2基因根据其在成熟果实中表达量由大到小排列依次为EuFAD2-1、EuFAD2-2、EuFAD2-3、EuFAD2-4、EuFAD2-5，根据其在幼果中的表达量由大到小依次为EuFAD2-2、EuFAD2-1、EuFAD2-4、EuFAD2-3、EuFAD2-5（见表8和图5）。

表8 δ-12脂肪酸脱氢酶相关Unigene在杜仲幼果和成熟果中的表达量Table 8 Expression of related EuFAD2 Unigene in young fruit and mature fruit

图5 EuFAD2相关Unigene在杜仲幼果和成熟果中的表达差异Fig.5 Expression difference of related EuFAD2 Unigene in young fruit and mature fruit

2.6 杜仲 EuFAD3基因的多样性和表达调控规律

转录组分析结果表明，在杜仲成熟果实和幼果中α-亚麻酸生物合成关键酶基因FAD3共有6个拷贝，分别命名为EuFAD3-1-EuFAD3-6（见表9）。

表9 杜仲ω-3脂肪酸脱氢酶基因的多样性Table 9 Diversity of EuFAD3 genes

对表达差异的研究结果表明，6个FAD3基因中只有EuFAD3-6在成熟果实和幼果中具有显著的表达差异（见表10）。而且在成熟果实中表达量比幼果高出3.56倍（见图6）；而EuFAD3-1～EuFAD3-5的表达量均未达到显著水平。

表10 δ-15脂肪酸脱氢酶相关Unigene在杜仲幼果和成果中的表达量Table 10 Expression of related EuFAD3 Unigene in young fruit and mature fruit

图6 δ-15脂肪酸脱氢酶相关Unigene在杜仲幼果和成果中的表达差异Fig.6 Expression difference of related EuFAD3 Unigene in young fruit and mature fruit

EuFAD3-1～EuFAD3-6根据其在幼果中的表达量由大到小排序依次为：EuFAD3-2、EuFAD3-1、EuFAD3-3、EuFAD3-5、EuFAD3-4、EuFAD3-6；依据其在成熟果实中的表达量由大到小排序依次为：EuFAD3-1、EuFAD3-2、EuFAD3-3、EuFAD3-4、EuFAD3-5、EuFAD3-6；在成熟果实中EuFAD3-1、EuFAD3-4、EuFAD3-5、EuFAD3-6等4个EuFAD基因的表达量均超过幼果，这与成熟果实的α-亚麻酸含量远超过幼果的情况基本一致。

3 结论与讨论

文中研究了杜仲α-亚麻酸合成途径重要基因的遗传多样性和表达规律，并鉴定了全长cDNA。在幼果和成熟中获得α-亚麻酸合成相关酶13条，其中差异表达基因6条，叶片和幼果获得6条基因，差异表达3条；酰基ACP硫脂酶（FatA）基因在幼果和成熟果实表达量无显著差异；硬脂酰-ACP去饱和酶（SAD）基因由4个家族成员（EuSAD1-EuSAD4）组成，在成熟果实中均有表达，而幼果中只有EuSAD1表达，EuSAD1在幼果和成熟果实中表达量无显著差异，但幼果表达量较高，幼果还是成熟果实均以EuSAD1为主；δ-12脂肪酸脱氢酶（FAD2）基因遗传多样性较高，由5个家族成员（EuFAD2-1-EuFAD2-5）组成，EuFAD2-1和EuFAD2-2在幼果和成熟果实中表达量达到显著水平，EuFAD2-1-EuFAD2-3的表达量果实高于叶片，而EuFAD2-4和EuFAD2-5幼果高于成熟果实，作用机理较复杂；ω-3脂肪酸脱氢酶（FAD3）基因家族由6个成员组成（EuFAD3-1-EuFAD3-6），只有EuFAD3-6表达量具有显著差异，且成熟果实比高出3.56倍，而EuFAD3-1～EuFAD3-5表达量均未达到显著水平，成熟果实EuFAD3-1、EuFAD3-4-EuFAD3-6等4个基因表达量超过幼果，这可能与成熟果实α-亚麻酸含量远高于幼果的情况一致。

杜仲籽油不饱和脂肪酸含量达91.18%，其中α-亚麻酸高达67.60%，α-亚麻酸被世界卫生组织确定为人体自身不能合成的必需脂肪酸，具有促进脑发育、增强智力，保护视力，降血脂，降血压，抑制血栓性疾病，预防心肌梗塞和脑梗塞，抑制过敏，抑制癌症的发生和转移、抗衰老等多种功能；α-亚麻酸ALA的生物合成途径：硬脂酸在Δ9-脂肪酸脱氢酶的催化下生成油酸，油酸在Δ12-脂肪酸脱氢酶的催化下生成亚油酸，随后，亚油酸进入多不饱和脂肪酸代谢的n-3途径或直接进入n-6途径。在n-3途径中，LA在Δ15-脂肪酸脱氢酶的催化下转化成α-亚麻酸；而在n-6途径中，LA经Δ6-脂肪酸脱氢酶的催化生成γ-亚麻酸。α-亚麻酸合成过程中的关键酶基因中FatA的遗传多样性较低，不同植物中保守性较强，而SAD、FAD2和FAD3遗传多样性都较高，如杜仲中SAD至少包含4个成员，FAD2至少包含5个家族成员，FAD3至少包含6个成员，而且这些家族成员的表达模式及不同器官中的表达特异性均不一致，表现出了亚麻酸合成过程中的多样化及复杂性。如杜仲成熟果实中3个SAD基因均表达，而幼果中只有EuSAD1表达，FAD2的5个家族成员EuFAD2-1和EuFAD2-2在幼果和成熟果实中表达量达到显著水平，EuFAD2-1-EuFAD2-3的表达量果实高于叶片，而EuFAD2-4和EuFAD2-5幼果高于成熟果实，作用机理较复杂，FAD3基因家族由6个成员组成，仅有EuFAD3-6表达量具有显著差异，且成熟果实比幼果高，成熟果实中大部分基因如EuFAD3-1、EuFAD3-4-EuFAD3-6等基因表达量超过幼果，这可能与成熟果实α-亚麻酸含量远高于幼果的情况一致，另一方面表现出了该基因在亚麻酸合成过程的调控的复杂性，需要进一步研究。

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