阿德福韦酯治疗失败的慢性乙型肝炎患者HBV反转录酶区新变异rtN236V的表型耐药特点分析

王晓，刘妍，思兰兰，陈丽，白文林，刘立明，王嫣，许智慧，戴久增，姚增涛，徐东平

核苷(酸)类似物是目前临床慢性乙型肝炎抗病毒治疗的主要药物，可有效抑制病毒复制，改善肝功能，延缓肝脏疾病的进展，但其作用常因长期服药引发的耐药问题而部分甚至全部抵消[1-2]。阿德福韦酯(ADV)是继拉米夫定(LAM)之后第二种应用于临床的抗病毒药物，短期内可有效抑制野生株和LAM耐药株的复制，但长期服用易产生耐药，其5年耐药率可达29%[3]。经典的ADV耐药突变形式为rtA181V和rtN236T，关于rtN236位点的其他变异目前尚未见国内外文献报道。本研究采用克隆测序方法对1例ADV治疗失败患者血清病毒池中的HBV反转录酶(RT)区基因变异进行鉴定，在rtN236位点检出了新变异形式rtN236V，并对其表型耐药特点进行分析，以期丰富临床对ADV耐药变异的认识，并为临床及时调整治疗方案提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 病毒DNA提取试剂盒购自北京天恩泽公司；XhoⅠ、SphⅠ内切酶和T4DNA连接酶购自大连宝生物公司；pGEM-Teasy载体购自美国Promega公司；pTriEx-HBV 1.1倍载体由法国里昂大学Zoulim教授惠赠；FuGENE HD转染试剂购自美国Roche公司；DMEM细胞培养基购自Gibco公司；荧光定量PCR检测试剂盒购自上海复星公司。克隆测序由北京天一辉远公司完成。

1.2 研究对象 解放军302医院2010年1月收治的1例48岁男性慢性乙型肝炎患者，HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性，无重叠或混合感染。诊断标准按2000年9月(西安)全国会议修订的《病毒性肝炎防治方案》[4]执行，常规检测项目由本院临检中心完成。该患者于2008年10月首次接受ADV抗病毒治疗，15个月后出现病毒学突破和生化学突破，血清HBV DNA载量由阴性上升为2.41×105U/ml，ALT由29U/L上升为66U/L。

1.3 方法

1.3.1 HBV RT区基因突变及基因型分析 取冻存于－20℃的患者血清，提取HBV DNA，采用巢式PCR方法扩增HBV RT基因[5]。对PCR产物进行DNA双向测序，对rt173、rt180、rt181、rt184、rt202、rt204、rt236和rt250位的经典LAM、ADV、恩替卡韦(ETV)相关耐药位点进行分析[6]。胶回收纯化上述PCR产物，与pGEM-Teasy载体连接，转化JM109感受态细胞，挑选34个菌落PCR鉴定阳性的样品送测序并分析耐药突变。按文献[7]中的方法进行HBV基因分型。

1.3.2 pTriEx-HBV 1.1倍重组载体构建及鉴定 提取含rtN236V、rtN236T和rtA181V+N236V突变形式的质粒及野生型质粒，经XhoⅠ/SphⅠ双酶切后连接至经同样酶切后的pTriEx-HBV 1.1载体，连接产物转化JM109感受态细胞，接种至LB固态琼脂板(含100μg/ml氨苄西林)，37℃温箱培养过夜。随机挑取克隆测序，对重组质粒进行鉴定，制备转染阳性质粒备用。

1.3.3 细胞转染及表型耐药分析 分别提取野生病毒株和突变株重组载体质粒，用FuGENE HD转染试剂按每孔0.25μg质粒转染入人肝癌细胞系HepG2细胞中，转染4h后分别加入不同浓度的LAM(0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)，ADV(0、0.033、0.1、0.33、1、3.3μmol/L)，ETV(0、0.001、0.01、0.1、1、10μmol/L)和替诺福韦(TDF)(0、0.01、0.1、1、10、100μmol/L)，隔天换液，换液2次后即转染第4天收集细胞培养上清，采用实时荧光定量PCR法检测上清中HBV DNA含量(反映病毒复制力)，计算药物半数有效剂量IC50及耐药倍数(突变株与野生株IC50的比值)。

2 结 果

2.1 HBV RT区基因突变检测及基因分型结果 测序分析显示该患者HBV RT区耐药突变为rtN236V/T共存，在34个阳性克隆中，20个(58.8%)为rtN236V变异株，11个(32.4%)为rtN236T变异株，2个(5.9%)为野生株，1个(2.9%)为rtA181V+N236V变异株。分型结果显示该患者为C2基因亚型HBV感染。

2.2 pTriEx-HBV 1.1倍重组载体的构建及鉴定 如图1所示，电泳结果显示2个条带，即约7000bp的载体片段和1000bp的HBV RT区片段，测序进一步证实载体构建成功。

图1 4种重组载体的XhoⅠ/SphⅠ双酶切鉴定Fig.1 Identification of four recombinant plasmids by XhoⅠ/SphⅠ dual-enzyme digestionM. Marker (1kb); 1. rtWT; 2. rtN236T; 3. rtN236V; 4. rtA181V+N236V

2.3 变异HBV复制力测定 实时荧光定量PCR法检测结果显示，野生株病毒复制力为(4.00±2.36)×107U/ml，rtN236T、rtN236V和rtA181V+N236V变异株的病毒复制力均有所降低，分别为野生株的89.43%、83.60%和75.44%。

2.4 表型耐药结果分析 与野生株比较，rtN236T、rtN236V、rtA181V+N236V变异株对LAM、ETV、TDF三种药物均敏感，而对ADV显示出不同水平耐药性。rtN236T株对ADV敏感性降低，其耐药倍数(变异株EC50/野生株EC50)是野生株的4.75倍；rtA181V+N236V株的耐药倍数为野生株的5.10倍；rtN236V株对ADV的敏感性介于rtN236T和野生株之间，其耐药倍数为野生株的3.10倍(表1)。

表1 HBV各变异株及野生株对4种药物的敏感性Tab.1 Susceptibility of wild-type and mutant HBV to LAM, ADV, ETV and TDF in vitro

3 讨 论

核苷(酸)类似物是当前临床抗HBV治疗最常用的药物，其抗病毒作用靶位是HBV RT区，而对病毒复制初始模板细胞核内的cccDNA没有直接抑制作用，因此需要长期用药才可达到持久抑制病毒的目的[8]。HBV是高变异的DNA病毒，可在长期药物和机体免疫压力下发生适应性变异，或因预存的极少量变异株获得选择性扩增，使耐药病毒逐渐成为优势种群，最终导致耐药，而随后的病毒学和生化学突破又加速了肝病的进展，严重者甚至可引起肝衰竭[9]。ADV是继LAM之后第二种应用于临床的核苷酸类药物，因其可在短期内有效抑制野生病毒及LAM耐药病毒的复制而在临床广泛使用，但长期使用仍可引发耐药。初治患者ADV的5年耐药率为29%，针对LAM耐药患者长期单药ADV治疗后ADV耐药率明显增加，4年累积可达43%[2,10-12]。

本例研究对象为2010年1月解放军302医院收治的48岁男性慢性乙型肝炎患者，服用ADV 15个月后出现病毒学突破，血清HBV DNA载量由阴性上升为2.41×105U/ml，ALT由29U/L上升为66U/L，克隆测序显示病毒准种池中含有大量rtN236V变异株，同时伴有rtN236T、rtA181V+N236V及野生株。已知rtA181V和rtN236T是经典的ADV耐药变异形式[3]，而目前国内外未见有关rtN236位点其他变异的文献报道，为鉴定新的rtN236V变异是否与ADV耐药相关，我们进一步分析了rtN236V变异株的体外病毒复制力及表型耐药特点。

体外实验结果显示，与野生株相比，rtN236V、rtN236T、rtA181V+N236V变异株的复制力均有不同程度下降。表型耐药结果显示rtN236T、rtA181V+N236V和rtN236V变异株的EC50分别是野生株的4.75、5.10倍和3.10倍。临床通常将抗病毒药物的耐药分为3个级别：耐药倍数2~9倍为低水平耐药，10~99倍为中等水平耐药，大于100倍为强耐药。但是这一划分范围在体外表型耐药实验中也存在例外，体外实验中ADV敏感性小幅度的增长(2~9倍)即可导致耐药[13]。该患者病毒池中大量存在的rtN236V变异株虽然单独对ADV耐药的贡献较小(3.10倍)，但与经典的rtA181V和rtN236T变异株共同存在时，会协同增加变异株对ADV的耐药性(5.10倍)，最终导致患者对ADV耐药，进而出现后续的病毒学和生化学突破。

新的耐药变异形式鉴定一般要满足以下几个过程：首先在临床病例中发现与药物应用相关的变异；其次体外实验证实突变株的病毒适应力；然后表型耐药实验分析突变株对抗病毒药物的耐药倍数；最后通过长期大样本的临床观察得出最终结论[14-15]。总之，本研究从1例ADV治疗失败的慢性乙型肝炎患者病毒池中鉴定的与rtN236T和rtA181V共同存在的rtN236V变异，可能是一个新的ADV耐药变异形式。核苷酸类药物治疗过程中及时监测耐药基因变异，对于及时调整临床治疗方案、提高抗病毒疗效具有重要意义。

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