响应面法优化木薯淀粉制备低聚异麦芽糖工艺

王镇发 李夏兰 陈培钦

（华侨大学化工学院生物工程系，厦门 361021）

低聚异麦芽糖（isomaltooligosaccharide，IMO），是淀粉糖的一种，主要成分为α－1，6－糖苷键结合的异麦芽糖（IG2）、潘糖（P）、异麦芽三糖（IG3）及四糖（含四糖）以上（Gn）的低聚糖［1］。低聚异麦芽糖具有促进双歧杆菌超强增殖、抗龋齿、消除疲劳、促进钙的吸收、增强机体免疫力、润肠通便等生理功能［2－4］。又因其具有低甜度、低热值、低黏度、保湿性、非发酵性、耐酸热性等特性，所以被广泛应用于各类保健品、饮品、奶制品、糖果和面食等［5］。它是功能性低聚糖中产量最大，应用最广泛，集营养、保健、疗效于一体的被称为21世纪的新型生物糖源。

以玉米淀粉为原料制备低聚异麦芽糖目前已经实现工业化，但是以木薯淀粉为原料制备低聚异麦芽糖的研究较少。木薯淀粉的粗蛋白、脂肪和灰分含量比玉米淀粉少，而支链淀粉比玉米高，水解产物的分支低聚糖含量更高，这些特性对生产分支低聚糖都非常有利［6－8］。我国木薯资源丰富，利用木薯淀粉为原料采用多种酶联合作用制备低聚异麦芽糖，可以大幅度提高木薯淀粉资源的附加值，同时为木薯资源的综合利用开辟一条新的途径。

1　材料与方法

1.1　原料与试剂

木薯淀粉：聚祥（厦门）淀粉有限公司。葡萄糖，麦芽糖，异麦芽糖，麦芽三糖，潘糖，异麦芽三糖：均为色谱纯，美国sigma公司；乙腈：霍尼韦尔中国有限公司；耐高温α－淀粉酶（酶活为68 U／mL，自制稀释）、真菌α－淀粉酶（酶活为306 U／mL）、β－淀粉酶（酶活为13 U／mL）：诺维信中国有限公司；普鲁兰酶（酶活为11 U／mL，自制稀释）：无锡杰能科生物工程有限公司；α－转葡萄糖苷酶（酶活为13 U／mL，自制稀释）：日本天野制药株式会社；其他常规试剂均为国产或进口分析纯。

1.2　试验设备

Agilent1100高效液相色谱仪：美国 Agilent公司；电热恒温振荡水槽DKZ－2型：上海精宏实验设备有限公司；奥立龙CHNO60型pH计：上海华东电器集团有限公司。

1.3　试验方法

1.3.1 木薯淀粉制备低聚异麦芽糖工艺流程

需要说明的是，在木薯淀粉制备低聚异麦芽糖过程中糖化和转苷的温度和pH相同；低聚异麦芽糖的主要成分为异麦芽糖、潘糖和异麦芽三糖［9］，分析对象为这3种糖之和。

1.3.2 响应面法试验设计

单因素试验考虑了液化时间、糖化时间、真菌α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普鲁兰酶酶量、糖化转苷温度、糖化转苷pH、α－转移葡萄糖苷酶酶量对异麦芽糖、潘糖以及异麦芽三糖之和（简称：IG2＋P＋IG3）的影响。根据单因素试验结果选取真菌α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普鲁兰酶酶量、糖化转苷温度、糖化转苷pH、α－转移葡萄糖苷酶酶量6个因素和IG2＋P＋IG3作为响应值进行6因素三水平的Box－Behnken响应面设计。采用高效液相色谱法分析异麦芽糖、潘糖以及异麦芽三糖的含量［1］。

1.3.3 响应面法试验数据分析

利用Design Expert 8.0.6软件中的Box－Behnken Design模型，对上述6个因素进行响应面分析，并对所获得的响应面回归模型进行显著性检验。

2　结果与讨论

2.1　单因素试验

液化时间从50到190 min，IG2＋P＋IG3在不断降低，这是因为随着时间的增加淀粉液化的DE值不断增加，而低的DE值有利于生成较多的低聚异麦芽糖和较少的葡萄糖；又当液化时间为40 min时液化后的木薯淀粉液很容易退化，不易进行试验，所以液化时间选为50 min。糖化时间从0～8 h，间隔2 h做一组试验，结果糖化时间为4 h时IG2＋P＋IG3最大且所用时间最短。糖化转苷在pH 4.0～5.4这个范围内，IG2＋P＋IG3随着pH的增大而增加；当pH大于5.4，IG2＋P＋IG3随着pH的增大而减少。糖化转苷温度范围35～60℃，在40℃时IG2＋P＋IG3最大。当β－淀粉酶添加量从0～0.20 mL时，IG2＋P＋IG3随着添加量的增加而迅速增加；当添加量大于0.20 mL时，IG2＋P＋IG3稍微减少一些，当添加量大于0.30 mL时，IG2＋P＋IG3趋向平衡，基本不变。当普鲁兰酶添加量从0～0.20 mL时，IG2＋P＋IG3随着添加量的增加而迅速增加；当添加量大于0.20 mL时，IG2＋P＋IG3随之减少。当 α－淀粉酶添加量从0～0.30 mL时，IG2＋P＋IG3随着添加量的增加而迅速增加；当添加量大于0.30 mL时，IG2＋P＋IG3稍微减少一些，当添加量大于0.40 mL时，IG2＋P＋IG3趋向平衡，基本不变。当α－转移葡萄糖苷酶添加量从0.02～0.10 mL时，IG2＋P＋IG3随着添加量的增加而迅速增加；当添加量大于0.10 mL时，IG2＋P＋IG3随着添加量的增加而减少。

2.2　Box－Behnken试验

根据单因素考察结果选取温度（X1，℃）、pH（X2）、α－淀粉酶酶量（X3，mL）、β－淀粉酶酶量（X4，mL）、普鲁兰酶酶量（X5，mL）和 α－转移葡萄糖苷酶酶量（X6，mL）作为考察因素，采用 Box－Behnken法6因素3水平进行试验，以IG2＋P＋IG3（R，mg／mL）作为响应值。试验安排及试验结果如表1。

表1　响应面试验安排表及结果

利用Design Expert软件，对数据进行多元回归拟合，获得以IG2＋P＋IG3对温度、pH、α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普鲁兰酶酶量和α－转移葡萄糖苷酶酶量的二次多项回归方程：R＝101.22－5.37X1＋3.05X2＋1.61X3－0.61X4＋2.47X5－6.16X6＋2.70X1X2－2.48X1X3＋0.31X1X4－1.79X1X5－0.55X1X6－2.03X2X3＋2.43X2X4－2.02X2X5＋5.47X2X6＋0.74X3X4＋1.14X3X5－0.018X3X6－0.89X4X5－1.55X4X6＋0.57X5X6－10.17X12－11.50X22－5.33X32－2.95X42－7.09X52－7.21X62

从回归模型方差（表2）可知，试验所选用的二次多项模型 F值为9.033，“Prob＞F”＜0.000 1，具有显著性；失拟项为0.158 0，影响不显著，说明模型不失拟；整个模型R2＝0.907 0，变异系数5.79%，表明方程的因变量与全体自变量之间的回归效果显著，此模型拟合较好。

表2　响应面试验方差分析结果

由表 2方差分析结果可知，X1、X2、X5、X6、X2X6、X12、X22、X32、X52、X62对生成IG2＋P＋IG3有显著或极显著的影响，其他因素影响相对较小；方程的一次项和二次项（P＜0.05）比较显著，因素的交叉项（P＞0.05）相互作用不显著，说明各个具体试验因素对响应值的影响是二次抛物面的关系，而各个因素之间的交互作用在试验中影响不大。

2.3　响应面分析

通过Design－Expert统计分析软件作响应曲面，可以直观地分析温度、pH、α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普鲁兰酶酶量和α－转移葡萄糖苷酶酶量6个因素之间交互作用对IG2＋P＋IG3的影响，结果见图1～图15所示。

从图1可知，IG2＋P＋IG3量受pH和温度共同影响，随着pH的增大，IG2＋P＋IG3量不断增加，但pH超过5.5，则不利于IG2＋P＋IG3量的增加；随着温度的升高，IG2＋P＋IG3量不断增加，在40℃左右达到最大值，之后随着温度的升高，IG2＋P＋IG3量不断下降；pH 5.50，温度为40℃时，IG2＋P＋IG3量达到最大值。从图2可知，IG2＋P＋IG3量受α－淀粉酶酶量和温度共同影响，当温度为35℃或者55℃时，增加α－淀粉酶酶量对IG2＋P＋IG3量的增加影响不大；当温度为40℃、α－淀粉酶酶量为0.25 mL（76.5 U）时，IG2＋P＋IG3量达到最大。从图3可知，β－淀粉酶酶量与温度相比，温度的改变对IG2＋P＋IG3量的影响更大；当温度为45℃、β－淀粉酶酶量为0.15 mL（1.95 U）时，IG2＋P＋IG3量达到最大。从图4可知，IG2＋P＋IG3量受普鲁兰酶酶量和温度共同影响，当普鲁兰酶酶量为0.25 mL（2.75 U）、温度为45℃时，IG2＋P＋IG3量达到最大。从图5可知，IG2＋P＋IG3量受α－转移葡萄糖苷酶酶量和温度共同影响，当α－转移葡萄糖苷酶酶量为0.10～0.15 mL（1.3～1.95 U）、温度为40～45℃时，IG2＋P＋IG3量达到最大。从图6至图9可知，IG2＋P＋IG3量受α－淀粉酶酶量、β－淀粉酶酶量、普鲁兰酶酶量、α－转移葡萄糖苷酶和温度共同影响，适当的酶量和温度有利于IG2＋P＋IG3量的增加。从图10可知，α－淀粉酶和β－淀粉酶相互作用对IG2＋P＋IG3的影响不大。从图11可知，普鲁兰酶酶量的变化比α－淀粉酶酶量的变化对IG2＋P＋IG3量的影响更大。从图12可知，α－转移葡萄糖苷酶酶量的变化比α－淀粉酶酶量的变化对IG2＋P＋IG3量的影响更大。从图13可知，普鲁兰酶酶量的变化比β－淀粉酶酶量的变化对IG2＋P＋IG3的影响更大。从图14可知，α－转移葡萄糖苷酶酶量的变化比β－淀粉酶酶量的变化对IG2＋P＋IG3量的影响更大。从图15可知，α－转移葡萄糖苷酶和普鲁兰酶共同影响IG2＋P＋IG3的量，α－转移葡萄糖苷酶酶量为0.10～0.15 mL（1.3～1.95 U）、普鲁兰酶酶量为0.25～0.35 mL（2.75～3.85 U）时，更有利于IG2＋P＋IG3量的增加。从上述分析可知pH和温度与酶的相互影响比较大，酶与酶之间的相互影响比较小。

图1　pH和温度对IG2＋P＋IG3的影响

图2　α－淀粉酶和温度对IG2＋P＋IG3的影响

图3　β－淀粉酶和温度对IG2＋P＋IG3的影响

图4　普鲁兰酶和温度对IG2＋P＋IG3的影响

图5　α－转移葡萄糖苷酶和温度对IG2＋P＋IG3的影响

图6　α－淀粉酶和pH对IG2＋P＋IG3的影响

图7　β－淀粉酶和pH对IG2＋P＋IG3的影响

图8　普鲁兰酶和pH对IG2＋P＋IG3的影响

图9　α－转移葡萄糖苷酶和pH对IG2＋P＋IG3的影响

图10　α－淀粉酶和β－淀粉酶对IG2＋P＋IG3的影响

图11　普鲁兰酶和α－淀粉酶对IG2＋P＋IG3的影响

图12　α－转移葡萄糖苷酶和α－淀粉酶对IG2＋P＋IG3的影响

图13　普鲁兰酶和β－淀粉酶对IG2＋P＋IG3的影响

图14　α－转移葡萄糖苷酶和β－淀粉酶对IG2＋P＋IG3的影响

图15　α－转移葡萄糖苷酶和普鲁兰酶对IG2＋P＋IG3的影响

2.4　优化工艺条件验证

通过Design－expert软件建立模型分析，得出以木薯淀粉（30%）为原料制备低聚异麦芽糖的最佳工艺条件：糖化转苷温度为41.9℃，糖化转苷pH 5.45，真菌α－淀粉酶酶量为30.60 U／g（淀粉）、β－淀粉酶酶量为1.04 U／g（淀粉）、普鲁兰酶酶量为1.10 U／g（淀粉）和α－转移葡萄糖苷酶酶量为0.48 U／g（淀粉）。液化条件固定为：耐高温α－淀粉酶酶量为2.27 U／g（淀粉）、液化时间为50 min、液化温度为90℃、液化pH 6.2。该条件下反应24 h，IG2＋P＋IG3的预测值为103.8 mg／mL。采用上述优化工艺进行验证试验，为104.3 mg／mL，与预测值的相对误差0.48%。可见此模型可以较好地预测IG2＋P＋IG3的量。

3　结论

在研究单因素影响IG2＋P＋IG3的基础上，进一步采用Box－Behnken法响应面优化。响应面优化模型显著，失拟项不显著。优化后6个因素糖化转苷温度为41.9℃，糖化转苷pH 5.45，真菌α－淀粉酶酶量为30.60 U／g（淀粉）、β－淀粉酶酶量为1.04 U／g（淀粉）、普鲁兰酶酶量为 1.10 U／g（淀粉）和α－转移葡萄糖苷酶酶量为0.48 U／g（淀粉）。该条件下IG2＋P＋IG3为104.3mg／mL，即异麦芽糖、潘糖以及异麦芽三糖总和为0.417 2 g／g（淀粉），与预测值的相对误差为0.48%。说明该模型具有一定的应用价值。

［1］GB／T 20881—2007低聚异麦芽糖［S］

［2］Kohmoto T，Fukui F，Takaku H，et al.Dose－response test of isomaltooligosaccharides for increasing fecal bifidobacteria［J］.Agricultural and biological chemistry，1991，55（8）：2157－2159

［3］Valette P，Pelenc V，Djouzi Z，et al.Bioavailability of new synthesised glucooligosaccharides in the intestinal tract of gnotobiotic rats［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，1993，62（2）：121－127

［4］赵晋，王娇，阚健全.低聚异麦芽糖生理功能及应用的研究进展［J］.食品研究与开发，2007，28（2）：166－170

［5］王良东.低聚异麦芽糖性质、功能、生产和应用［J］.粮食与油脂，2008（4）：43－47

［6］张齐军，覃兰芳，陶静，等.木薯淀粉生产异麦芽低聚糖粉的工艺研究［J］.广西轻工业，2000（2）：5－7

［7］阚翠姝，白玉玲.不同品种淀粉特性的研究与应用［J］.现代面粉工业，2009，23（4）：41－45

［8］陈玲，温其标，叶建东.木薯淀粉微细化及颗粒形貌的研究［J］.粮食与饲料工业，1999（12）：41－43

［9］邹耀洪，孙佳.低聚异麦芽糖制备工艺研究［J］.常熟高专学报，2003，17（2）：41－46.